一、背景
麥芽香肉桿菌PCR試劑盒采用PCR技術(shù)，針對(duì)麥芽香肉桿菌的基因高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物，用PCR技術(shù)對(duì)麥芽香肉桿菌的核酸進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測(cè)，在反應(yīng)體系中含麥芽香肉桿菌核酸模板的情況下，PCR反應(yīng)進(jìn)行特異性擴(kuò)增，利用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，依據(jù)特異性擴(kuò)增片段的結(jié)果，判斷待檢樣品中是否含有豬細(xì)小病毒源性成分，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的定性分析。
二、麥芽香肉桿菌PCR試劑盒使用方法
1、樣品處理（樣本處理區(qū)）
1.1樣本前處理
取懸浮的口腔樣本或糞便樣本100ul，加入1.5ml離心管中，用DNA核酸提取試劑盒進(jìn)行提取即可。
1.2 DNA提取
根據(jù)您實(shí)驗(yàn)室的具體情況和樣品類(lèi)型，選擇適當(dāng)?shù)奶崛〔呗苑椒?。為了使?shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定、有效、可靠，建議使用商品化的試劑盒進(jìn)行提取，嚴(yán)格按照對(duì)應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，樣本核酸提取過(guò)程中應(yīng)避免污染，提取好的模板樣品如不能立即檢測(cè)，建議-15℃以下保存。
2、試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）
2.1從-15℃以下冰箱中取出試劑盒平衡到室溫（20～25℃），注意避免強(qiáng)光照射，待完全溶解后振蕩混勻并低速離心10 s，使用低吸附吸頭分液取樣，避免試劑損失和浪費(fèi)。
2.2根據(jù)待檢測(cè)樣本總數(shù)，設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照；樣品每滿(mǎn)7份，多配制1份)，
2.3在適當(dāng)容積的無(wú)菌離心管中加入上述試劑，充分振蕩混勻后2000 rpm離心10 s，按照20μL/管分裝量將試劑分裝至八聯(lián)PCR反應(yīng)管中。
2.4蓋緊八聯(lián)PCR反應(yīng)管蓋,并注意做好相應(yīng)標(biāo)識(shí)（請(qǐng)標(biāo)記在八聯(lián)PCR反應(yīng)管蓋兩端突出部位，切勿標(biāo)記在八聯(lián)PCR反應(yīng)管蓋中間）。將PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至樣本準(zhǔn)備區(qū)，剩余試劑放回-15℃以下冰箱冷凍保存。
3、加樣（樣本處理區(qū)）
將步驟1提取的DNA、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取5μL，加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心，核酸加樣過(guò)程中應(yīng)避免污染。
備注：模板濃度高或存在PCR抑制物，需用超純水稀釋模板DNA，DNA濃度低于50ng/ul，可加5μL模板，高濃度DNA可能抑制PCR反應(yīng)。
4、PCR擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）
4.1將待檢測(cè)反應(yīng)管置于PCR儀反應(yīng)槽內(nèi),并記錄放置順序；
5、結(jié)果分析判定
5.1電泳檢測(cè)
取10-20μL PCR產(chǎn)物。電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。本產(chǎn)品提供的擴(kuò)增液在擴(kuò)增結(jié)束后可以直接上樣，不需要另外再加loading buffer。
5.2麥芽香肉桿菌PCR試劑盒電泳結(jié)果判斷
PCR產(chǎn)物陽(yáng)性對(duì)照必須有目的片段大小的條帶出現(xiàn)，陰性對(duì)照必須無(wú)任何擴(kuò)增，否則實(shí)驗(yàn)無(wú)效。對(duì)沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物的樣品，可以稀釋10倍后重復(fù)PCR擴(kuò)增以排除PCR抑制劑的感染。
三、應(yīng)用
麥芽香肉桿菌PCR試劑盒可以用于豬源沙門(mén)菌分離鑒定及鼠李糖乳桿菌預(yù)防斷奶仔豬腹瀉效果研究：
研究主要從沙門(mén)菌臨床株分離鑒定、沙門(mén)菌ELISA(Enzyme linked immuno sorbentassay)檢測(cè)方法建立與應(yīng)用、LGG對(duì)沙門(mén)菌感染仔豬腸道菌群影響,以及實(shí)際生產(chǎn)中LGG對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能和免疫功能影響等方面進(jìn)行研究,
主要結(jié)果如下：
(1)斷奶仔豬腹瀉沙門(mén)菌的分離鑒定與耐藥性檢測(cè)。從全國(guó)26個(gè)省市,123家養(yǎng)殖場(chǎng)采集的806份腹瀉仔豬腸道內(nèi)容物、糞便樣品中,分離得到173株沙門(mén)菌,分離率比較高的省市是河北、山東、湖南、湖北、重慶;鑒定出7種血清型,以鼠傷寒沙門(mén)菌為主(125株),16種毒力基因的陽(yáng)性率為100%;氨芐西林、四環(huán)素、氯霉素和氟苯尼考的耐藥率大于70%,復(fù)方新諾明的耐藥率為100%,但均對(duì)阿米卡星敏感。
(2)鼠傷寒沙門(mén)菌FljB抗體間接ELISA建立與應(yīng)用。對(duì)分離的鼠傷寒沙門(mén)菌鞭毛蛋白FljB進(jìn)行原核表達(dá),建立了沙門(mén)菌間接ELISA檢測(cè)方法。建立的程序?yàn)閜ET-32a-FljB重組蛋白,以6μg/mL包被酶標(biāo)板,37℃孵育1 h后4℃過(guò)夜,5%BSA封閉2h,待檢血清100μ/孔,37℃作用30min,1:10000稀釋的酶標(biāo)二抗,100μL/孔,37℃作用30min,TMB顯色10min,加入終止液,酶標(biāo)儀OD450讀取數(shù)值,并確定了OD450的陰陽(yáng)臨界值為0.34。建立的ELISA方法能特異性識(shí)別沙門(mén)菌,靈敏度高,三次的重復(fù)試驗(yàn)變異系數(shù)為1.0%～9.1%,且與商品試劑盒符合率達(dá)到93.4%。
(3)LGG對(duì)臨床分離沙門(mén)菌感染斷奶仔豬腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響。利用高通量測(cè)序技術(shù)分析回腸黏膜菌群,結(jié)果顯示,仔豬回腸黏膜的優(yōu)勢(shì)菌群是厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)、放線菌門(mén),分別占總豐度的85.00%、8.23%、6.15%。經(jīng)對(duì)比,魚(yú)乳酸桿菌、土壤芽胞桿菌、乳酸乳球菌是相對(duì)豐度最高的種,分別為43.63%、8.50%、8.00%,另外,蓋氏假單胞菌(2.06%)、大洋沉積物芽胞桿菌(1.49%)、微桿菌AT1b(1.27%)、麥芽香肉桿菌(1.11%;使用商品化的麥芽香肉桿菌PCR試劑盒檢測(cè))的相對(duì)豐度也超過(guò)1%。
(4)LGG對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)性能和免疫功能的影響。按照1 kg/1000 kg飼料的比例添加LGG凍干粉(1010CFU/g),斷奶仔豬連續(xù)飼喂3周,LGG停止添加后再繼續(xù)觀察2周。添加LGG提高仔豬終末重,提高平均日增重及飼料轉(zhuǎn)化率,降低腹瀉發(fā)病率。添加LGG顯著提高第4、5周的仔豬體重,增加第3、4、5周的平均日增重及飼料轉(zhuǎn)化率,可以顯著降低第3、4、5周的仔豬腹瀉率。對(duì)血液免疫球蛋白分析發(fā)現(xiàn),LGG提高了第1周仔豬血液IgM及第3、4、5周仔豬血液IgG的濃度,第5周仔豬血液IgA濃度明顯升高。
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