一、背景
諾氏梭狀芽孢桿菌PCR試劑盒是一種專門用于檢測諾氏梭狀芽孢桿菌的體外診斷試劑。它采用了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)，能夠在短時間內(nèi)快速、準(zhǔn)確地檢測出諾氏梭狀芽孢桿菌。
諾氏梭狀芽孢桿菌PCR試劑盒的主要成分包括PCR反應(yīng)液、DNA模板、引物、酶等。其中，PCR反應(yīng)液是PCR反應(yīng)的基礎(chǔ)，包含PCR反應(yīng)所需的各種成分，如緩沖液、離子、酶等。DNA模板是含有諾氏梭狀芽孢桿菌特異性基因序列的DNA片段，用于擴增出特異性片段。引物是一段與DNA模板特異性結(jié)合的短序列，用于啟動PCR反應(yīng)。酶是熱穩(wěn)定的DNA聚合酶，用于催化DNA合成。
使用諾氏梭狀芽孢桿菌PCR試劑盒時，需要將DNA模板、引物和PCR反應(yīng)液混合后進行PCR反應(yīng)。在適宜的溫度和條件下，引物與DNA模板特異性結(jié)合，并通過酶的催化進行DNA合成，最終得到大量的特異性DNA片段。通過凝膠電泳等技術(shù)對這些片段進行檢測和分析，可以確定是否存在諾氏梭狀芽孢桿菌。
二、諾氏梭狀芽孢桿菌PCR試劑盒操作流程
1、整個檢測過程應(yīng)嚴格按照本說明書要求分別在試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本處理區(qū)和PCR擴增區(qū)進行操作，各區(qū)實驗服、儀器、耗材應(yīng)獨立使用，不能混用；實驗用吸頭采用帶濾芯吸頭；樣本處理區(qū)應(yīng)配有生物安全柜，樣本處理在生物安全柜中進行操作；三個區(qū)應(yīng)該配有紫外線殺菌裝置。
2、為避免RNA降解，樣本處理過程應(yīng)在0-4℃條件下操作，且完成實驗后立即上機檢測；樣本處理過程中使用的器具耗材應(yīng)經(jīng)過無核酶處理。
3、每次實驗應(yīng)該設(shè)置陰、陽性對照。
4、試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻，并應(yīng)瞬時離心。
5、試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在一次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū)，并單獨存放。
6、為防止熒光干擾，應(yīng)避免裸手直接接觸PCR反應(yīng)管，并應(yīng)避免在PCR反應(yīng)管上進行任何標(biāo)記。
7、儀器擴增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說明書相關(guān)要求進行設(shè)置；不同批號試劑不能混用。
8、ABI系列熒光定量PCR儀參數(shù)設(shè)置中不選ROX校正，淬滅基因選擇None。
9、實驗過程中產(chǎn)品的廢棄物應(yīng)該進行無害化處理后方可丟棄。
三、應(yīng)用
諾氏梭狀芽孢桿菌PCR試劑盒可以用于諾氏梭菌孢子聯(lián)合化療治療裸鼠移植肝癌的實驗研究：
諾氏梭菌孢子(C.novyi-NT)在體外對人肝癌細胞HuH-7細胞系的毒性作用及對血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達的影響
研究在體外厭氧條件下,諾氏梭菌孢子(C.novyi-NT)對體外培養(yǎng)的人肝癌細胞HuH-7細胞系的毒性作用及其對VEGF表達與分泌的影響。
材料與方法：采用諾氏梭狀芽孢桿菌PCR試劑盒篩選諾氏梭菌菌落收集梭菌孢子；采用細胞培養(yǎng)技術(shù),以人肝癌細胞HuH-7細胞系為靶細胞,將HuH-7細胞隨機分成對照組、梭菌孢子組及阿霉素組,厭氧培養(yǎng)條件下分別加入磷酸鹽緩沖液(PBS液)、諾氏梭菌孢子C.novyi-NT及阿霉素。處理12小時、24小時、48小時及72小時后,應(yīng)用WST-1比色法測定各不同處理方法對人肝癌細胞HuH-7細胞系的毒性(0D值)。
應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA法)測定反應(yīng)24小時、48小時及72小時后對照組及梭菌孢子組細胞培養(yǎng)基上清液中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)蛋白含量。應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法(RT-PCR法)分析厭氧培養(yǎng)72小時后對照組及梭菌孢子組HuH-7細胞的VEGF mRNA表達水平。
結(jié)果：將梭菌孢子C.novyi-NT加入體外培養(yǎng)的人肝癌細胞HuH-7細胞后顯示出毒性作用和對該細胞系的生長抑制效應(yīng)。加入梭菌孢子C.novyi-NT作用12小時后,細胞生長開始出現(xiàn)停滯,細胞呈圓形或球形,胞漿中出現(xiàn)顆粒狀物質(zhì)。72小時后,細胞培養(yǎng)基中出現(xiàn)更多細胞碎片。
厭氧培養(yǎng)條件下,細胞損傷隨時間的延長逐漸加劇。24小時后,梭菌孢子C.novyi-NT的細胞毒性作用明顯強于對照組,兩組0D值具有顯著差異,與阿霉素組相比無明顯差異。24、48、72小時細胞上清液中VEGF的量,梭菌孢子組與對照組相比無明顯統(tǒng)計學(xué)差異；但72小時后,梭菌孢子組厭氧培養(yǎng)的細胞VEGF mRNA表達水平明顯高于對照組(p=0.012)。
結(jié)論：在厭氧培養(yǎng)條件下諾氏梭菌孢子(C.novyi-NT)對體外培養(yǎng)的人肝癌細胞HuH-7細胞系有明顯的細胞毒性作用,且影響VEGF的mRNA表達。
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