微生物的誘變和突變回復(fù)試驗原理與操作步驟！
小楊 / 2024-03-08 08:44:54
一、實驗原理
紫外線是一種最常用的物理誘變因素，它的主要作用是使DNA雙鏈中的兩個相鄰的嘧啶核苷酸形成二聚體，并阻礙雙鏈的解開和復(fù)制，從而引起基因突變，最終導(dǎo)致表形的變化，如產(chǎn)生色素能力的消失，喪失合成某種氨基酸的能力，以及抗藥性的變化等。紫外線照射后造成的DNA損傷，一般在可見光照射下，由于光激活酶的作用，可將嘧啶二聚體解開，使其恢復(fù)正常，這稱為光復(fù)活作用。為避免光復(fù)活，當用紫外線進行誘變處理時及處理后的操作都應(yīng)在紅光下進行，并且應(yīng)將微生物在黑暗的條件下進行培養(yǎng)。
亞硝基胍（NTG）是一種揮發(fā)性的烷化劑，具有很強的誘變作用，它的作用機制主要是引起NTGDNA鏈中G：
C——A：T的轉(zhuǎn)換，它的殺菌作用雖很低，但在存活菌中突變率很高。故成為超級誘變劑。
艾姆氏試驗的基本原理是利用鼠傷寒沙門氏菌的組氨酸營養(yǎng)缺陷型（his-）菌株發(fā)生回復(fù)突變性能來檢測物質(zhì)的誘變及致癌性能，此菌株在不含組氨酸的基本培養(yǎng)基上不能生長，但遇有誘變性能的物質(zhì)后可發(fā)生回復(fù)突變，因而在基本培養(yǎng)基上也能生長，形成肉眼可見的菌落，因此可以在短時間內(nèi)，根據(jù)回復(fù)突變發(fā)生的頻率來判定該物質(zhì)是否具有誘變或致癌的性能。由于有些被檢測的致癌劑需要哺乳動物肝細胞中的羥化酶系統(tǒng)激活后方能顯示致突變物的活性，所以在進行試驗時還需要加入哺乳動物肝細胞內(nèi)微粒體的酶作為體外活化系統(tǒng)（S-9混合液），提高陽性物的測出率。所以艾姆氏試驗也稱鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體試驗。
二、實驗步驟
（一）紫外線的誘變作用
1、菌懸液的準備
（1）將1299菌株轉(zhuǎn)接完全培養(yǎng)基斜面，32℃培養(yǎng)24小時。
（2）自斜面取一接種環(huán)菌接與20ml/250 ml三角瓶的肉湯培養(yǎng)基中，32℃培養(yǎng)18小時。
（3）取培養(yǎng)液離心3000 rpm離心15分鐘，棄去上清液，用生理鹽水洗菌體兩次，再加適量的生理鹽水。顯微鏡直接計數(shù)法，使菌體濃度為108個/ml。
2、誘變處理
（1）吸取上述無菌液10mL于無菌平皿中（皿內(nèi)放一攪拌子，下為磁力攪拌器），放在15W紫外燈下,距離28.5cm照射60秒，取出放在紅燈下，將上述經(jīng)誘變處理的菌懸液以10倍稀釋法，具體可按估計的存活率進行稀釋。
（2）取各稀釋率下的菌液0.1 ml接于肉湯培養(yǎng)基中，用黑紙包好，32℃培養(yǎng)48小時。
3、淘汰野生型
（1）取肉湯培養(yǎng)基3000 rpm離心15分鐘，以生理鹽水洗滌兩次，加到5mL無氮培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)4~6小時。
（2）加入與無氮培養(yǎng)基等量的二倍氮培養(yǎng)基，培養(yǎng)3~4小時再加青霉素，使青霉素的最終濃度為200單位/毫升。放置3小時。
（3）取上述菌液0.1毫升涂于完全培養(yǎng)基平板上，32℃培養(yǎng)8小時。
4、營養(yǎng)缺陷型菌株的檢出
（1）準備完全培養(yǎng)基和基本培養(yǎng)基平板各三個。將劃有若干小格并編號的圓形紙貼到平板的背面。
（2）用無菌牙簽選取菌落，分別接種于基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基的相應(yīng)位置，32℃培養(yǎng)24小時。
（3）在完全培養(yǎng)基上生長而在基本培養(yǎng)基上不生長的菌落，轉(zhuǎn)接在完全培養(yǎng)基斜面上，32℃培養(yǎng)24~48小時。
5、營養(yǎng)缺陷型類型的鑒定
（1）營養(yǎng)缺陷型分為氨基酸、核酸堿基、維生素三大類物質(zhì)。
（2）將待測菌株制成細胞懸液，濃度為108個/ml。
（3）制作基本培養(yǎng)基混菌平板。
（4）待冷凝后分為三個區(qū)，標明氨基酸，堿基，維生素，用接種針將相應(yīng)物質(zhì)放在各區(qū)中間。
（5）37℃培養(yǎng)24小時，觀察生長情況，哪個區(qū)生長，就說明缺陷型菌株需要哪類物質(zhì)。
6、營養(yǎng)缺陷型具體營養(yǎng)要求的鑒定
（1）將待測菌株制成細胞懸液，濃度為108個/ ml。
（2）制作基本培養(yǎng)基混菌平板。
（3）對于具體氨基酸缺陷型的鑒定，可先將各種氨基酸分為6組，如表1，將待測平皿分為六區(qū)，分別將6組氨基酸點在六區(qū)中央位置，30℃培養(yǎng)24小時，觀察生長譜（表2）即可確定具體所需要的營養(yǎng)物質(zhì)。
（4）核酸堿基缺陷型的鑒定（只做4種物質(zhì)），將待測平皿分為四區(qū)，在中央位置分別點上，黃嘌呤、腺嘌呤、鳥嘌呤，次黃嘌呤，37℃培養(yǎng)24小時，觀察生長情況，即可確定具體所需營養(yǎng)物質(zhì)。
7、復(fù)測
經(jīng)上述步驟確定的各菌株的營養(yǎng)要求，再以所確定的純一的營養(yǎng)物質(zhì)所配制的補充培養(yǎng)基復(fù)測一次，如果在補充培養(yǎng)基上生長，在對照的基本培養(yǎng)上不生長，則該菌無疑是這種物質(zhì)的缺陷型。
（二）NTG對谷氨酸棒桿菌1299的誘變效應(yīng)
1、制備含菌平板
（1）將活化的斜面菌種挑一環(huán)接種于5ml的肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜。
（2）次日，按5％接種量取上述菌液于肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)6－7h。
（3）取0.2mL菌液于完全培養(yǎng)基平板上，用無菌涂棒將菌液均勻的涂滿整個平板表面，倒置培養(yǎng)2h。
2、誘變處理
在上述含菌平板的中央和其他部位放少許NTG結(jié)晶，然后將培養(yǎng)皿倒置于37℃恒溫箱中，培養(yǎng)24h。
3、增殖培養(yǎng)
放有NTG藥物的周圍有一透明的抑菌圈，緊靠抑菌圈有一個生長較密集的生長圈，用接種環(huán)挑取該處菌苔于裝有20mL肉湯培養(yǎng)生物科學(xué)與工程系微生物學(xué)教學(xué)研究室基的三角瓶中，于37℃恒溫箱中，培養(yǎng)過夜，使誘變后的突變體進行繁殖，以增加菌數(shù)。
4、淘汰野生型
（1）培養(yǎng)菌液：取增殖后的菌液5mL于無菌離心管中，3500r/min離心10min，倒去上清夜，再用生理鹽水洗滌兩次，離心，去上清液后的約1/10菌液接種到5mL無氮基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h。
（2）加青霉素：取上述菌液5mL加到5mL高滲培養(yǎng)液的三角瓶中，再加入青霉素，使最終濃度約為500單位/mL，再置于37℃恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)6h，離心，棄去上清夜，重新懸浮于5mL無氮基本培養(yǎng)基中置冰箱保存。
（3）涂布平板：取上述培養(yǎng)液的原液和10－1、10－2的稀釋液各0.1mL，分別涂布于完全培養(yǎng)基平板上，置于37℃恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h，然后選取合適的平板（約長有50－200個菌落）用作營養(yǎng)缺陷型的檢查（如無合適平板，可取保存于冰箱中經(jīng)青霉素處理過的菌液再行稀釋、涂布）。
5、缺陷型的檢出
同紫外線誘變處理的缺陷型的檢出。
(三)艾姆氏試驗檢測突變回復(fù)
1、組氨酸營養(yǎng)缺陷型(his+)鑒定
基于菌株只能在含組氨酸的培養(yǎng)基上生長、無組氨酸的培養(yǎng)基上不能生長的原因,將下層培養(yǎng)基融化,冷卻至50℃左右,倒入4個培養(yǎng)皿內(nèi),冷凝后倒置過夜制成底層平板。從測試菌株TA100及對照菌株斜面各取一環(huán)分別接入肉膏蛋白胨培養(yǎng)液內(nèi)，37℃，培養(yǎng)16~24h后離心，取菌體并用生理鹽水洗滌3次，然后制成菌懸液（濃度1~2×109/mL）。取氯化鈉瓊脂融化并冷卻至45℃左右，保溫，各管加0.1mL菌液,每個菌株做兩管,迅速搖勻并倒在底層平板上鋪勻.在各培養(yǎng)皿背面用記號比標出1,2,3三點.翻轉(zhuǎn)平皿,打開皿蓋,在“1”處加微量的組氨酸顆粒,“2”處滴加組氨酸-生物素混合液1小滴,“3”處不加作為對照。37℃，培養(yǎng)2天，觀察結(jié)果，要求結(jié)果為檢測菌株為組氨酸-生物素缺陷型。
2、亞硝基胍致突變效應(yīng)的檢測
（1）自發(fā)回復(fù)突變對照
將下層培養(yǎng)基融化后倒入平皿，制成底層平板。上層培養(yǎng)基融化后冷至45℃左右，加0.1mL菌懸液、0.5mLS-9混合液,不加待測樣品液。經(jīng)37℃培養(yǎng)48h后，觀察在下層平板上長出的菌落表示為該菌自發(fā)回復(fù)突變后生成。記錄并算出每組平皿菌落平均數(shù)/皿，以Rc表示。
突變率（MR）=每皿誘變菌落均數(shù)（Rt）/每皿自發(fā)回復(fù)突變菌落均數(shù)（Rc）
只有突變率〉2才認為樣品屬艾姆氏試驗陽性。當試驗樣品濃度達到500μg/皿仍未能出現(xiàn)陽性結(jié)果時，便可報告該待測樣品屬艾姆氏試驗陰性。
對于陽性結(jié)果的樣品，其試驗結(jié)果尚要經(jīng)統(tǒng)計分析，若計算劑量與回變菌落之間有可重復(fù)的相關(guān)系數(shù)，經(jīng)相關(guān)顯著性檢驗，最后才能確認為陽性。
（2）陰性對照
為說明樣品本身確為艾姆氏試驗陽性而與配制樣品液所用的溶劑無關(guān)，所以陰性對照是采用配制樣品時的溶劑。
3、亞硝基胍致突變效應(yīng)的檢測
取測試菌珠1管接肉膏培養(yǎng)基活化，37℃，培養(yǎng)16~24h后離心，將菌體用生理鹽水洗滌3次，最后配成濃度為1~2×109/mL菌懸液備用.融化下層培養(yǎng)基并倒入6套平皿制成平板,用記號筆作好標記.做1μg、5μg、10μg三種濃度,每濃度每菌重復(fù)兩皿。取上層培養(yǎng)基6管融化并冷卻至45℃左右，標記各管1~6號。每管加TA100菌懸液0.1mL、0.5mLS-9混合液到1~6管.迅速搖勻后,倒在底層平板上,待凝固后在每皿中央放置1片直徑為6mm無菌濾紙片。在1、2各皿的濾紙上滴加濃度為50μg /mL的NTG0.02mL,在3、4各皿濾紙滴加250μg NTG0.02mL,在5、6各皿濾紙滴加500μg NTG0.02mL,即終濃度為1μg、5μg、10μg。37℃，培養(yǎng)48h觀察結(jié)果。
北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司擁有對菌種、細胞、培養(yǎng)基、配套試劑等產(chǎn)品需求者的極優(yōu)質(zhì)服務(wù)，對購買項目的前期資料提供,中期合同保證,后期貨物跟蹤到最終售后的確保項目準確到位，都有相關(guān)人士進行維護,確保您在
微生物菌種查詢網(wǎng)中獲得最優(yōu)質(zhì)服務(wù)！也正因為此，北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司與國內(nèi)外多家研制單位、生物制藥、第三方檢測機構(gòu)和科研院所院校、化工企業(yè)有著良好、長期和穩(wěn)定的合作關(guān)系！
下載附件
上一篇：常用殺滅和抑制微生物的化學(xué)方法有哪些？
下一篇：如何預(yù)防保健食品微生物的污染及生產(chǎn)安全？