單核細胞增生李斯特菌染料法熒光定量PCR試劑盒！
小楊 / 2024-03-14 08:46:04
一、產(chǎn)品特點
1、即開即用，用戶只需要提供病毒樣品。
2、根據(jù)單核細胞增生李斯特菌保守序列設計的專一性引物，與相關病毒無交叉反應。
3、靈敏度可以達到幾百拷貝/反應。
4、一管式熒光定量 PCR 檢測，避免后續(xù)污染。
5、本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應體系的熒光定量 PCR。
6、本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷。
二、使用方法
（一）樣品采集：
1、食品樣品：樣品的采集與預培養(yǎng)按照樣品的采集與預培養(yǎng)按照《食品衛(wèi)生微生物學檢驗阪崎腸桿菌檢驗要求進行。
2、血液樣品：用無菌注射器抽取受檢者靜脈血2mL，注入無菌EDTA2Na(或檸檬酸鈉)抗凝管，立即混勻。
3、糞便樣品：取糞便置于滅菌的收集管中送檢。
4、病灶部位樣品：取發(fā)病部位新鮮滲出物、粘液膿血送檢。
（二）稀釋 PCR 陽性對照（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）
1、注意：由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的 DNA 片段作為陽性對照。
2、標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
3、用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。
4、在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩 1 分鐘，得1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
5、換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
6、換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
7、重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。
注：上述樣品建議經(jīng)過增菌后，收集培養(yǎng)物用于檢測。
（三）DNA提取：
可采用PCR試劑盒配備的DNA抽提液，按以下說明進行DNA核酸的粗提。也可采購上海澤葉生物科技有限公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒(過柱法-熒光配套)或其他合適的商業(yè)化產(chǎn)品，并按照相應試劑盒說明進行操作。
1、液體培養(yǎng)物：取液體培養(yǎng)物100μL加到1.5mL無菌離心管中，8000rpm離心3min，盡量吸棄上清，加入50μL DNA抽提液充分混勻，100℃恒溫10min，13000rpm離心3min，取上清5μL進行PCR反應。
2、固體培養(yǎng)物：挑取單克隆菌落與50μL DNA抽提液充分混勻，100℃恒溫10min，13000rpm離心3min，取上清5μL進行PCR反應。
3、糞便樣品：挑取米粒大小糞便于滅菌離心管中，加入0.5mL生理鹽水，振蕩混勻，13000rpm離心3分鐘，棄上清，沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混勻，100℃恒溫10min，13000rpm離心3min取上清5μL進行PCR反應。
4、其他液體標本：取標本2-3mL，13000rpm離心3min，棄上清，沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混勻，100℃恒溫10min，13000rpm離心3min取上清5μL進行PCR反應。
注：陽性對照和陰性對照為已經(jīng)抽提好的核酸(無需提取)，直接取5μL加入到反應體系中即可。由于陽性對照濃度較高，建議最后在樣品制備區(qū)域加入陽性對照。
三、檢測步驟
設置qPCR反應（20μL體系，在樣品制備室進行）
如果只做1次重復，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照，6個用于PCR陽性對照。如果做2-3次重復，則反應設置數(shù)量相應增加2或3倍。
四、結果分析
1、結果分析條件設定
直接讀取檢測結果?；€和閾值設定原則根據(jù)儀器噪聲情況進行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴增曲線的最高點為準。
2、試驗成立判定
1）陰性對照(NTC)：不應產(chǎn)生任何的擴增曲線。
2）陽性對照(ESKZ -PTC)：均產(chǎn)生擴增曲線，且Ct值≤35。
3）以上條件應同時滿足，否則，此次試驗視為無效。
3、結果判定
1）在試驗成立的條件下，Ct值≤35的樣本為陽性，表明阪崎腸桿菌核酸陽性。
2）Ct值顯示為無的樣本為陰性樣本，表明阪崎腸桿菌核酸陰性。
3）如果35＜Ct值≤40，判為可疑樣品。對于可疑樣品，先看擴增曲線。如果擴增曲線為對數(shù)擴增曲線，則為可疑陽性，否則判為陰性。
4）對于可疑陽性樣品，重新抽提核酸，再次進行阪崎腸桿菌real time PCR檢測。如果重復擴增曲線為對數(shù)擴增曲線，判為樣本陽性，表明阪崎腸桿菌核酸陽性；否則判為樣本陰性。
五、注意事項
1）初次使用前請仔細閱讀說明書。并嚴格按照說明書步驟操作。
2）所有使用的離心管應高壓滅菌，而且必須不含DNA酶。
3）PCR操作應嚴格按照要求分區(qū)(試劑配制區(qū)、標本處理區(qū)、PCR擴增區(qū)等)，防止實驗室污染。
4）樣本提取、試劑配置、加樣需在不同區(qū)的超凈工作臺進行，以免污染。
5）試劑盒里所有物品應視為污染物對待，按照衛(wèi)生部《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理。
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