微生物細胞大小的測定和顯微鏡直接計數(shù)！
小楊 / 2024-03-18 09:08:02
一、實驗目的
1、學習接目測微計的校正方法，了解血球計數(shù)板的構(gòu)造和計數(shù)原理。
2、學習使用顯微鏡測微尺測定微生物細胞大小，掌握用血球計數(shù)板測定微生物細胞總數(shù)的方法。
二、實驗原理
微生物細胞的大小是微生物分類鑒定的重要依據(jù)之一。微生物個體微小，必須借助于顯微鏡才能觀察，要測量微生物細胞大小，也必須借助于特殊的測微計在顯微鏡下進行測量。
顯微測微計由鏡臺測微計和目鏡測微計兩部分組成。后者可直接用于測量細胞大小。它是一塊圓形玻片，其中央有精確等分到度，測量時將其放在接目鏡中的隔板上。由于目鏡測微計所測量的是微生物細胞經(jīng)過顯微鏡放大之后所成像的大小，刻度實際代表的長度隨使用的目鏡和物鏡放大倍數(shù)及鏡筒的長度而改變，所以，使用前須先用鏡臺測微計進行標定，求出某一放大率下，目鏡測微計每一小格所代表的長度，然后用目鏡測微計直接測被測對象的大小。鏡臺測微計是一塊中央有精確刻玻片，刻度的總長為lmm，等分為100小格，每小格長10um，專用于對目鏡測微計進行標定的。
三、實驗材料
1、器械
顯微鏡、目鏡測微尺、鏡臺測微尺，載玻片、蓋玻片、血球計算板、擦鏡紙、吸水紙、玻片架、腎形盤、洗瓶、接種環(huán)、酒精燈、火柴、滴管。
2、菌種
培養(yǎng)48h的啤酒酵母斜面菌體和菌懸液。
3、革蘭氏染液
四、操作流程
1、置目測微計→置臺測微計→標定目測微計→測菌體大小→記錄結(jié)果→用畢擦拭干凈
2、檢查計數(shù)板→稀釋樣品→加樣→計數(shù)→計算→清洗
五、操作步驟
1、微生物菌體大小的測定
（1）目鏡測微尺的校正
①更換目鏡鏡頭
更換目鏡測微尺鏡頭（標記為PF）；或者取下目鏡上部或下部的透鏡，在光圈的位置上安上目鏡測微尺，刻度朝下，再裝上透鏡，制成一個目鏡測微尺的鏡頭。
②某一倍率下標定目鏡刻度
將鏡臺測微尺置于載物臺上，使刻度面朝上，先用低倍鏡對準焦距、看清鏡臺測微尺的刻度后，轉(zhuǎn)動目鏡，使目鏡測微尺與鏡臺測微尺的刻度平行，移動推動器使兩尺重疊，并使二尺的左邊的某一刻度相重合，向右尋找另外二尺相重合的刻度。記錄兩重疊刻度間的目鏡測微尺的格數(shù)和鏡臺測微尺的格數(shù)。
③計算該倍率下目鏡刻度
目鏡測微尺每格長度=鏡臺測微尺格數(shù)/目鏡測微尺格數(shù)xl0um
④標定并計算其他放大倍率下的目鏡刻度
以同樣方法分別在不同倍率的物鏡下測定目鏡測微尺每格代表的實際長度。如此測定后的測微尺的長度，僅適用于測定時使用的顯微鏡以及該目鏡與物鏡的放大倍率。
（2）菌體大小的測定
①將啤酒酵母制成水浸片。
②大小換算
將標本先在低倍鏡下找到目的物，然后在高倍鏡下用目鏡測微尺測定每個菌體長度和寬度所占的刻度，即可換算成菌體的長和寬。
③求平均值
一般測量微生物細胞的大小，用同一放大倍數(shù)在同一標本上任意測定l0一20個菌體后，求出其平均值即可代表該菌的大小。
2、用血球計數(shù)板測定微生物細胞的數(shù)量
（1）檢查血球計數(shù)板
取血球計數(shù)板一塊，先用顯微鏡檢查計數(shù)板的計數(shù)室，看其是否沾有雜質(zhì)或干涸著的菌體，若有污物則通過擦洗、沖洗，使其清潔。鏡檢清洗后的計數(shù)板，直至計數(shù)室無污物時才可使用。
（2）稀釋樣品
將培養(yǎng)后的酵母培養(yǎng)液振蕩振搖混勻，然后作一定倍數(shù)的稀釋。稀釋度選擇以小方格中的分布的菌體清晰可數(shù)為宜。一般以每小格內(nèi)含4～5個菌體的稀釋度為宜。
（3）加樣
取出一塊干凈蓋玻片蓋在計數(shù)板中央。用滴管取1滴菌稀釋懸液注入蓋玻片邊緣，讓菌液自行滲入，若菌液太多可用吸水紙吸去。靜置5—10分鐘。
（4）鏡檢
待細胞不動后進行鏡檢計數(shù)。先用低倍鏡找到計數(shù)室方格后，再用高倍鏡測數(shù)。一般應取上下及中央五個中格的總菌數(shù)。計數(shù)時若遇到位于線上的菌體，一般只計數(shù)格上方（下方）及右方（左方）線上的菌體。每個樣品重復3次。
（5）計算
取以上計數(shù)的平均值，按下列公式計算出每毫升菌液中的含菌量。
菌體細胞數(shù)（cfu/mL）＝小格內(nèi)平均菌體細胞數(shù)×400×104×稀釋倍數(shù)
（6）清洗
計數(shù)板用畢后先用95%的形酒精輕輕擦洗，再用蒸餾水淋洗，然后吸干，最后用擦鏡紙揩干凈。若計數(shù)的樣品是病原微生物，則須先浸泡在5%石炭酸溶被中進行消毒，然后再行清洗。清洗后放回原位，切勿用硬物洗刷。
六、結(jié)果
1、計算出目鏡測微尺在低、高倍鏡下的刻度值。
2、記錄菌體大小的測定結(jié)果。
3、計算樣品中酵母菌濃度。
七、思考
1、為什么隨著顯微鏡放大倍數(shù)的改變，目鏡測微計每格相對的長度也會改變？能找出這種變化的規(guī)律嗎？
2、根據(jù)測量結(jié)果，為什么同種酵母菌的菌體大小不完全相同？
3、能否用血球計數(shù)板在油鏡下進行計數(shù)？為什么？
4、根據(jù)自己體會，說明血球計數(shù)板計數(shù)的誤差主要來自那些方面？如何減少誤差？
八、附錄
目鏡測數(shù)尺有兩種：一是特制的目鏡鏡頭，鏡片上刻有50等分或100等分的刻度，使用時直接安裝在顯微鏡上，取代沒有刻度的目鏡鏡頭；另一種是一塊直徑大約17.5 mm的圓玻璃片，其中央刻有50等分或100等分的刻度，使用時將該玻璃片安裝在原來的目鏡鏡頭上即可。由于不同的顯微鏡放大倍數(shù)不同，既使同一顯微鏡在不同的目鏡、物鏡組合下其放大倍數(shù)也不同，故目鏡測微尺每格實際表示的長度隨顯微鏡放大倍數(shù)不同而異。也就是說，目鏡測微尺上的刻度只代表相對的長度。因此在使用前須用鏡臺測微尺校正，以確定在一定放大倍數(shù)下目鏡測微尺的每格長度。
血球計數(shù)板是一塊特別的厚玻片，玻片中央分剖成兩個平面，上面各刻有9區(qū)，中央一區(qū)為計數(shù)室，供計數(shù)用，此區(qū)的長和寬各為1mm。中央平面兩側(cè)有小溝，小溝外有兩條突起的平臺，平臺比中央平面高0.1mm，因此計數(shù)室體積為0.1mm3，容積為10-4ml。通常計數(shù)室分為25個大格，每大格又分為16個小格，每小格容積為4×10-6ml，即lml菌液容積相當于400萬個小格體積。因此只要將細胞懸液注人計算室，計算出一定數(shù)量小格的平均菌數(shù)即可算出每毫升的細胞數(shù)。
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