嗜水氣單胞菌分離株的鑒定與菌株腸毒素及致病性研究！
小楊 / 2024-04-17 09:26:16
嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila,以下簡(jiǎn)稱Ah)廣泛分布于污水、池水及河底土壤中,為革蘭陰性桿菌,是引起腹瀉的新病原菌。關(guān)于此菌的感染, 國(guó)外有較多報(bào)道, 而國(guó)內(nèi)僅見(jiàn)有零星報(bào)道。近年來(lái),我們對(duì)云南邊防部隊(duì)感染性腹瀉進(jìn)行病原監(jiān)測(cè),采集腹瀉患者糞便標(biāo)本328份,在分離多種腸道病原菌的同時(shí),從中分離出5株Ah,該菌經(jīng)鏡檢、培養(yǎng)、法國(guó)梅里埃VITEK32微生物全自動(dòng)分析儀系統(tǒng)鑒定及電子顯微鏡下觀察予以證實(shí),并對(duì)菌株進(jìn)行了腸毒素及致病性研究，報(bào)道如下。
一、材料和方法
1、菌株來(lái)源
從云南邊防部隊(duì)感染性腹瀉患者糞便標(biāo)本中分離。
2、分離培養(yǎng)
將腹瀉患者糞便標(biāo)本接種于SS瓊脂平板上置37℃孵箱培養(yǎng)18～24h，挑取可疑菌落進(jìn)行純培養(yǎng)。
3、生化鑒定
采用常規(guī)法和法國(guó)梅里埃VITEK32全自動(dòng)微生物分析儀NFC卡進(jìn)行系統(tǒng)鑒定。
4、電子顯微鏡檢查
將分離菌接種普通肉湯培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)18h, 2%磷鎢酸(PH6.4)負(fù)染制樣,用日立－2型電鏡檢查。
5、侵襲性測(cè)定
采用豚鼠角膜試驗(yàn)（Sereny test）。
6、腸毒素測(cè)定
采用乳鼠灌胃法測(cè)定熱穩(wěn)定性腸毒素(ST)。
7、致病力測(cè)定
15～18g健康小白鼠（購(gòu)自昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）雌雄兼用，隨機(jī)分成試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組5只，試驗(yàn)組注射Ah肉湯培養(yǎng)物，每只0.5ml,觀察小白鼠發(fā)病情況，對(duì)照組同法注射無(wú)菌肉湯，觀察7d。
8、藥敏試驗(yàn)
采用K-B紙片擴(kuò)散法。藥敏紙片系北京天壇生物技術(shù)開發(fā)公司產(chǎn)品，在有效期內(nèi)使用。
二、結(jié)果
1、生物學(xué)特性
在SS瓊脂平板上經(jīng)37℃培養(yǎng)24h,其菌落形態(tài)為圓形，半透明、邊緣整齊、光滑、濕潤(rùn)、微隆、直徑1～2mm。菌體形態(tài)為革蘭陰性桿菌，兩端鈍圓呈單或呈雙排列。在暗視野下觀察運(yùn)動(dòng)極為活潑，在電子顯微鏡下可見(jiàn)極端鞭毛（見(jiàn)圖1）。
2、系統(tǒng)生化鑒定
VITEK32全自動(dòng)微生物分析儀NFC卡系統(tǒng)鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。表1 分離的嗜水氣單胞菌生化特征試驗(yàn)項(xiàng)目結(jié)果
3、侵襲力測(cè)定
豚鼠角膜試驗(yàn)陰性。
4、腸毒素測(cè)定
經(jīng)乳鼠灌胃試驗(yàn)測(cè)試，分離的5株Ah腸/體之比均大于0.083,分別是0.091、0.105、0.087、0.123、0.096。證明產(chǎn)生較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性腸毒素（ST）。
5、致病力測(cè)定
5株分離菌肉湯培養(yǎng)物分別腹腔注射小白鼠后，均在24h左右發(fā)病，表現(xiàn)為弓背、聳毛、運(yùn)動(dòng)遲緩、食欲不振，雙眼半閉、呼吸急促等癥狀，72h內(nèi)相繼死亡。解剖死亡的小白鼠，發(fā)現(xiàn)腸水腫，腸腔積液等，取腸內(nèi)容物培養(yǎng)，仍獲原感染菌。注射無(wú)菌肉湯的對(duì)照組觀察7d無(wú)不良反應(yīng)。
6、藥敏試驗(yàn)
在所試的12種抗菌藥物中 ，對(duì)9種敏感，1種中度敏感，3種耐藥，見(jiàn)表2。表2 分離的嗜水氣單胞菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果抗菌素紙片含量（略）注：S: 敏感； MS: 中度敏感； R：耐藥。
三、討論
1、Ah是氣單胞菌屬中的細(xì)菌之一，該菌廣泛存在于水環(huán)境中，是一種人—畜—水生動(dòng)物共患病病原菌。此類菌致病性決定于某些菌株的侵襲力、熱穩(wěn)定性腸毒素和不穩(wěn)定性腸毒素，該毒素和溶血素為氣單胞菌類主要致病因子。該分離菌侵襲力測(cè)定為陰性，產(chǎn)熱穩(wěn)定性腸毒素（ST），致病性測(cè)定有較強(qiáng)的致病力，與臨床癥狀密切相關(guān)。我們從邊防部隊(duì)腹瀉病人糞便標(biāo)本中分離出5株Ah，患者的主要臨床表現(xiàn)是：類似急性胃腸炎，癥見(jiàn)腹瀉、嘔吐、腹痛，無(wú)發(fā)熱。Ah不僅感染動(dòng)物，而且也是引起人類腹瀉的新病原菌。由于條件所限，未做不穩(wěn)定腸毒素和溶血素測(cè)試。目前，國(guó)外已將Ah納入腹瀉病原菌的檢測(cè)范圍。
2、
氣單胞菌屬的細(xì)菌通常不產(chǎn)生賴氨酸脫羧酶，但與致病性有關(guān)的氣單胞菌賴氨酸脫羧酶陽(yáng)性率較高，如本次分離的5株Ah賴氨酸脫羧酶均為陽(yáng)性。對(duì)Ah的研究，國(guó)內(nèi)很少有人用電子顯微鏡觀察其菌體形態(tài)，我們使用了較先進(jìn)的電鏡對(duì)分離的Ah進(jìn)行觀察，有助于對(duì)菌體結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)。使用先進(jìn)的VITEK32全自動(dòng)微生物分析儀對(duì)其菌株進(jìn)行鑒定，具有快速、省事、省力且結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。由于Ah的生化特性與腸干菌科、弧菌屬、鄰單胞菌屬較為相似，沒(méi)有先進(jìn)設(shè)備的基層單位，可利用氧化酶試驗(yàn)、粘絲試驗(yàn)、鳥氨酸脫羧酶和甘露醇、肌醇發(fā)酵等反應(yīng)來(lái)鑒別。腹瀉病原感染因子的研究在臨床治療上具有重要意義，不同細(xì)菌的感染因子所需的首選藥物不盡相同，我們做的藥敏試驗(yàn)，篩選出敏感、中度敏感、耐藥三類藥敏譜，對(duì)指導(dǎo)部隊(duì)和地方今后治療Ah的感染具有重要的指導(dǎo)意義。
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