硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn)是一種常用的鑒定細(xì)菌的方法。它是根據(jù)某些細(xì)菌能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽與醋酸作用，生成亞硝酸，亞硝酸與試劑中的對(duì)氨基苯磺酸作用生成重氮基苯磺酸，后者與α-萘酚反應(yīng)生成紅色的N-α-苯胺偶氮苯磺酸。若試驗(yàn)菌可利用硝酸鹽產(chǎn)亞硝酸鹽進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為氮?dú)?，則小倒管中會(huì)有氣體囤積，判定為陽(yáng)性。
方法：取可疑菌落接種在含小導(dǎo)管的硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基內(nèi)，35℃培養(yǎng)24小時(shí)，小導(dǎo)管內(nèi)有氣體產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，否則為陰性。
原理：硝酸鹽胨水培養(yǎng)基主要用于硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)。蛋白胨、酵母粉提供碳氮源、維生素和生長(zhǎng)因子；硝酸鉀為可利用的硝酸鹽。銅綠假單胞菌是一類專性需氧菌、以有機(jī)碳作為能源的異養(yǎng)硝化菌，能通過(guò)產(chǎn)生的酶分四步還原硝酸鹽，將硝酸鹽分解產(chǎn)生氮?dú)狻?/div>
用法：稱取本品15.5g,加熱溶解于1000ml蒸餾水中,分裝試管,并加入小倒管,115℃高壓滅菌20分鐘,備用。
三、應(yīng)用
從桑葉中分離到一株高產(chǎn)γ-氨基丁酸植物乳桿菌(γ-aminobutyric acid,GABA),命名為SG-5,該菌株GABA產(chǎn)量為7.24g/L,具有顯著抑制血管緊張素轉(zhuǎn)移酶能力。
為了明確其對(duì)動(dòng)物的安全性,本研究首先分析菌株SG-5的生物特性,然后從動(dòng)物毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)、有害代謝產(chǎn)物、菌株耐藥性三個(gè)方面來(lái)評(píng)價(jià)SG-5的安全性,最后應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)分析其對(duì)大鼠腸道微生物的影響,為其開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù),研究結(jié)果如下:
1、菌株SG-5的生物特性分析。對(duì)SG-5的耐膽鹽能力、耐酸堿穩(wěn)定性和耐熱性進(jìn)行研究,結(jié)果證明菌株在0.8%膽鹽濃度下的耐受力為39.19%,低于0.8%膽鹽濃度下均能存活,具有較強(qiáng)的耐膽鹽能力;SG-5在Na Cl質(zhì)量濃度低于8%的條件下均能存活,在8.0%Na Cl濃度的耐受力為17.73%;在酸性條件下p H>3.0時(shí)SG-5生長(zhǎng)良好,堿性條件下p H<8.0之間時(shí)生長(zhǎng)較為良好;用50℃的溫度水浴處理菌株半小時(shí)后,于37℃恒溫培養(yǎng),菌株生長(zhǎng)良好。
2、毒理學(xué)試驗(yàn)。首先進(jìn)行急性經(jīng)口毒性試驗(yàn),對(duì)SD大鼠連續(xù)以8×1012CFU/kg的劑量灌胃SG-5菌液14天,SD大鼠沒有異?，F(xiàn)象的發(fā)生,得到半數(shù)致死量LD50遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于6000mg/kg。然后對(duì)SD大鼠進(jìn)行28天經(jīng)口毒性試驗(yàn),將四周齡SD大鼠分為四組,根據(jù)大鼠體重按8×1012CFU/kg、8×1010CFU/kg、8×108CFU/kg、0CFU/kg的劑量連續(xù)灌胃28天,觀察喂養(yǎng)過(guò)程中有無(wú)中毒反應(yīng)。第29天對(duì)SD大鼠進(jìn)行麻醉解剖并采血,同時(shí)觀察有無(wú)臟器病變,對(duì)心、肝等臟器進(jìn)行指數(shù)分析,WBC、RBC等8項(xiàng)血液常規(guī)進(jìn)行檢查,K、Na等21項(xiàng)血液生化指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)進(jìn)行尿常規(guī)檢查。結(jié)果表明各項(xiàng)指標(biāo)在正常范圍內(nèi),且與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P>0.05)。未得到最小觀察有害作用劑量(LOAEL)和未觀察到有害作用劑量(NOAEL),說(shuō)明SG-5的NOAEL>8×1012CFU/kg。對(duì)大鼠臟器進(jìn)行細(xì)菌易位檢查,沒有易位現(xiàn)象生物發(fā)生。實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步表明SG-5為安全性菌株。
3、菌株SG-5有害代謝產(chǎn)物評(píng)價(jià)試驗(yàn)。細(xì)菌在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)某些有害代謝產(chǎn)物,用血平板對(duì)菌株SG-5進(jìn)行溶血實(shí)驗(yàn),沒有溶血現(xiàn)象;用氨基脫羧酶培養(yǎng)基培養(yǎng)SG-5菌株,檢測(cè)SG-5是否產(chǎn)生氨基脫羧酶,結(jié)果為陰性,說(shuō)明SG-5不產(chǎn)生氨基脫羧酶;用蛋白胨水培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株檢驗(yàn)是否具有分解色氨酸的能力,試驗(yàn)結(jié)果為陰性;同時(shí)用硝酸還原酶試劑盒檢測(cè)菌液中是否含有硝基還原酶,結(jié)果表明不產(chǎn)生硝基還原酶。
4、菌株SG-5耐藥性分析。使用KB藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)SG-5對(duì)哌拉西林等12種抗生素是否具有抗性,并提取SG-5的質(zhì)粒,檢測(cè)是否含有耐藥性基因,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SG-5對(duì)哌拉西林、阿莫西林、四環(huán)素、氯霉素、羅紅霉素、青霉素等6種抗生素敏感;對(duì)利福平、紅霉素中度敏感;對(duì)慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、環(huán)丙沙星等7種抗生素耐藥,菌株不含有耐藥性質(zhì)粒。
5、菌株SG-5對(duì)腸道微生物的影響。SD大鼠28天喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),收集大鼠的盲腸糞便,采用宏基因組學(xué)研究方法,利用高通量測(cè)序技術(shù)測(cè)定腸道的微生物菌落組成,進(jìn)行OUT及豐度等分析。
結(jié)果表明中劑量灌胃組(8×1010CFU/kg)盲腸微生物物種豐度、多樣性及乳酸菌含量大大增加,有害菌群減少。綜上所述,菌株SG-5為一株安全性菌株,適宜的劑量范圍能夠提高盲腸微生物的豐度及多樣性。
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