控制菌的檢驗(yàn)方法驗(yàn)證有哪些注意事項(xiàng)？該怎么操作呢？
小楊 / 2025-08-14 09:51:01
百歐博偉生物：控制菌檢驗(yàn)方法驗(yàn)證是確保檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，需結(jié)合樣品特性、目標(biāo)菌生物學(xué)特征及檢驗(yàn)方法的細(xì)節(jié)，規(guī)避潛在誤差。以下是核心注意事項(xiàng)：
一、樣品處理的合理性
1、基質(zhì)干擾的預(yù)判與處理
需提前分析樣品是否含抑菌成分（如防腐劑、抗生素、中藥中的抑菌成分），或物理狀態(tài)是否影響菌的分離（如油脂類、混懸液、高黏度樣品）。例如：
含酒精的樣品需先中和（如加硫代硫酸鈉）或稀釋至抑菌濃度以下；
油膏類樣品需用乳化劑（如吐溫 80）分散，避免菌被包裹無法生長(zhǎng)。
若樣品本身有殺菌 / 抑菌作用，必須通過預(yù)試驗(yàn)確認(rèn)干擾程度（如回收率＜50% 時(shí)，需采用稀釋、中和、膜過濾等方法消除干擾，且需驗(yàn)證這些處理措施本身對(duì)目標(biāo)菌無毒性）。
2、供試液制備的一致性
嚴(yán)格遵循方法規(guī)定的稀釋倍數(shù)、pH 值、溫度等參數(shù)，確保每次處理的供試液狀態(tài)一致（如混懸液需混勻后立即取樣，避免菌沉降導(dǎo)致濃度不均）。
二、目標(biāo)菌與對(duì)照菌的選擇
1、目標(biāo)菌的代表性
選用標(biāo)準(zhǔn)菌株（如 ATCC、CMCC 菌株），避免使用臨床分離株（可能因變異導(dǎo)致特性改變，影響驗(yàn)證結(jié)果）。例如：驗(yàn)證
大腸桿菌時(shí)，需用大腸桿菌，而非其他來源的菌株。
確保目標(biāo)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（活力強(qiáng)，易繁殖），菌懸液需新鮮制備（一般制備后 2h 內(nèi)使用，或 4℃冷藏不超過 24h），避免因菌老化導(dǎo)致回收率偏低。
2、陰性對(duì)照菌的針對(duì)性
陰性對(duì)照菌需選擇與目標(biāo)菌形態(tài)或生化特性相似的菌株，以驗(yàn)證方法的特異性。例如：
驗(yàn)證
金黃色葡萄球菌時(shí)，用表皮葡萄球菌（同屬、形態(tài)相似但生化特性不同）；
驗(yàn)證
沙門菌時(shí)，用大腸埃希菌（腸道菌，易混淆）。
三、試驗(yàn)設(shè)計(jì)的規(guī)范性
1、菌濃度的精準(zhǔn)控制
加入樣品的目標(biāo)菌濃度需嚴(yán)格控制在10-100 CFU（中國(guó)藥典等標(biāo)準(zhǔn)要求），過高可能掩蓋樣品的抑菌作用，過低則可能因隨機(jī)誤差導(dǎo)致結(jié)果不穩(wěn)定。
菌懸液的濃度需通過平板計(jì)數(shù)法校準(zhǔn)（而非僅靠比濁法估算），確保實(shí)際加入量符合設(shè)計(jì)要求。
2、對(duì)照試驗(yàn)的完整性
必須同時(shí)設(shè)置陽性對(duì)照（僅目標(biāo)菌，無樣品）、陰性對(duì)照（僅樣品，無目標(biāo)菌）和空白對(duì)照（僅培養(yǎng)基和試劑）：
陽性對(duì)照用于確認(rèn)目標(biāo)菌在試驗(yàn)條件下可正常生長(zhǎng)（排除培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件的問題）；
陰性對(duì)照用于確認(rèn)樣品本身不含目標(biāo)菌（避免假陽性）；
空白對(duì)照用于確認(rèn)試劑、環(huán)境無外源污染。
3、重復(fù)試驗(yàn)的必要性
關(guān)鍵項(xiàng)目（如檢出限、耐用性）需多次重復(fù)（至少 3 次，建議 5 次），避免單次試驗(yàn)的偶然性誤差。例如：檢出限驗(yàn)證中，需確保 1-5 CFU 的目標(biāo)菌在多次試驗(yàn)中均能被檢出（檢出率≥95%）。
四、培養(yǎng)基與試劑的質(zhì)量控制
1、選擇性培養(yǎng)基的適用性
控制菌檢驗(yàn)依賴選擇性培養(yǎng)基（如
大腸桿菌用麥康凱瓊脂，
金黃色葡萄球菌用甘露醇高鹽瓊脂），需驗(yàn)證其選擇性和促生長(zhǎng)能力：
促生長(zhǎng)：接種目標(biāo)菌后，菌落形態(tài)典型、生長(zhǎng)良好；
選擇性：非目標(biāo)菌（如陰性對(duì)照菌）在該培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)或生長(zhǎng)受抑制。
培養(yǎng)基需在有效期內(nèi)使用，且批次間差異需通過耐用性驗(yàn)證（換用 2-3 批培養(yǎng)基重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果一致）。
2、鑒定試劑的可靠性
生化鑒定試劑（如凝固酶試劑、靛基質(zhì)試劑）需在有效期內(nèi)，且通過陽性 / 陰性對(duì)照驗(yàn)證其有效性（如凝固酶試劑需用金黃色葡萄球菌驗(yàn)證陽性，表皮葡萄球菌驗(yàn)證陰性）。
五、培養(yǎng)條件的嚴(yán)格控制
1、溫度與時(shí)間的精準(zhǔn)性
培養(yǎng)溫度需穩(wěn)定（±1℃），避免因 incubator（培養(yǎng)箱）溫度不均導(dǎo)致結(jié)果偏差（如 35℃培養(yǎng)的目標(biāo)菌，若實(shí)際溫度降至 30℃可能生長(zhǎng)緩慢）。
培養(yǎng)時(shí)間需足夠（如沙門菌的增菌培養(yǎng)需 18-24h，不足則可能因菌量不足導(dǎo)致漏檢），但也不可過長(zhǎng)（可能導(dǎo)致雜菌過度繁殖干擾目標(biāo)菌）。
2、厭氧 / 微需氧條件的特殊性
若目標(biāo)菌為厭氧菌（如
破傷風(fēng)梭菌），需驗(yàn)證厭氧培養(yǎng)裝置的有效性（如厭氧袋的厭氧指示劑變色、氧氣濃度監(jiān)測(cè)），避免因氧氣殘留導(dǎo)致菌不生長(zhǎng)。
六、干擾處理措施的合理性
1、中和劑的選擇與驗(yàn)證
若使用中和劑（如 β- 內(nèi)酰胺酶中和青霉素，卵磷脂中和季銨鹽類防腐劑），需同時(shí)驗(yàn)證：
中和劑對(duì)抑菌成分的中和效果（樣品抑菌作用消失）；
中和劑本身對(duì)目標(biāo)菌無毒性（單獨(dú)加入中和劑的陽性對(duì)照菌生長(zhǎng)良好）。
2、膜過濾法的操作細(xì)節(jié)
濾膜孔徑需為0.45μm（確保目標(biāo)菌截留，抑菌成分通過）；
過濾時(shí)避免供試液過度濃縮（可能殘留抑菌成分），必要時(shí)用稀釋液沖洗濾膜（1-3 次，需驗(yàn)證沖洗不導(dǎo)致目標(biāo)菌流失）；
濾膜轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基時(shí)需完全貼合（避免氣泡影響菌生長(zhǎng)）。
七、結(jié)果判斷的客觀性
1、形態(tài)與生化特征的綜合判斷
不可僅憑菌落形態(tài)判斷，需結(jié)合生化試驗(yàn)（如
大腸桿菌需同時(shí)滿足靛基質(zhì)陽性、甲基紅陽性）和特異性鑒定（如
沙門菌的血清學(xué)凝集試驗(yàn)），避免假陽性。
對(duì)“疑似菌落”需進(jìn)一步確認(rèn)（如挑取多個(gè)菌落重復(fù)試驗(yàn)），防止漏檢。
2、陰性結(jié)果的謹(jǐn)慎處理
若試驗(yàn)組未檢出目標(biāo)菌，需排除以下可能：
樣品處理時(shí)目標(biāo)菌被意外殺滅（如溫度過高）；
培養(yǎng)基失效或培養(yǎng)條件錯(cuò)誤；
菌懸液濃度實(shí)際為 0（需核查陽性對(duì)照是否生長(zhǎng)）。
八、驗(yàn)證過程的記錄與追溯
1、原始數(shù)據(jù)的完整性
詳細(xì)記錄菌懸液濃度、樣品處理步驟、培養(yǎng)條件、菌落計(jì)數(shù)、生化反應(yīng)結(jié)果等，確?？勺匪?。
保留關(guān)鍵圖譜（如菌落形態(tài)照片、生化試劑顯色結(jié)果）。
2、方法變更的再驗(yàn)證
若樣品配方、生產(chǎn)工藝變更（可能引入新抑菌成分），或檢驗(yàn)方法參數(shù)調(diào)整（如培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)時(shí)間），需重新驗(yàn)證方法適用性。
九、總結(jié)
控制菌檢驗(yàn)方法驗(yàn)證的核心是“排除干擾、確保特異性、保證可重復(fù)性”，需從樣品處理、菌株選擇、試驗(yàn)設(shè)計(jì)到結(jié)果判斷的全流程嚴(yán)格把控，結(jié)合樣品特性和目標(biāo)菌生物學(xué)特征，避免因細(xì)節(jié)疏漏導(dǎo)致假陽性或假陰性結(jié)果，最終保證“不得檢出”的控制菌結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
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