原代培養(yǎng)的大鼠脈絡膜成纖維細胞在培養(yǎng)過程中需要注意什么？
小楊 / 2025-09-02 09:50:52
原代培養(yǎng)的
大鼠脈絡膜成纖維細胞因直接來源于活體組織，細胞狀態(tài)更接近體內(nèi)生理特性，但也具有分離難度高、對外界環(huán)境敏感、易污染、增殖能力有限等特點，培養(yǎng)過程中需精準控制各環(huán)節(jié)以保證細胞活性、純度和功能穩(wěn)定性。以下是關鍵注意事項，按“前期準備 - 分離操作 - 培養(yǎng)維護 - 質量監(jiān)控 - 特殊風險”分類說明：
一、前期準備：無菌與試劑適配是基礎
原代細胞對污染和試劑兼容性極敏感，前期準備需杜絕所有潛在風險：
1、無菌環(huán)境控制
操作需在生物安全柜（二級及以上） 內(nèi)進行，提前 30 分鐘開啟紫外消毒（≥20 分鐘），操作前用 75% 乙醇擦拭臺面、器械及操作者雙手 / 手套。
所有接觸細胞的耗材（培養(yǎng)皿、離心管、移液管、槍頭）需為無酶、無菌、無內(nèi)毒素規(guī)格，避免殘留化學物質或酶類損傷細胞（如胰蛋白酶殘留會導致細胞貼壁困難）。
培養(yǎng)箱需定期（每周 1 次）用 75% 乙醇擦拭內(nèi)壁，或用紫外消毒（關閉培養(yǎng)箱后進行），并監(jiān)測 CO?濃度（穩(wěn)定在 5%）和溫度（37℃±0.5℃），避免頻繁開關導致環(huán)境波動。
2、試劑選擇與預溫
培養(yǎng)基：需使用成纖維細胞專用培養(yǎng)基，添加 10%-15% 胎牛血清（FBS，需篩選無支原體、低內(nèi)毒素批次，避免血清質量差異導致細胞生長異常）、1% 青霉素 - 鏈霉素（雙抗，抑制細菌污染），可額外添加 5ng/mL 堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）促進增殖。
消化液：選擇 0.25% 胰蛋白酶 - EDTA（1:1），避免使用濃度過高或消化時間過長的胰酶（會破壞細胞表面蛋白）；消化前需將胰酶和培養(yǎng)基37℃預溫 10-15 分鐘，避免冷試劑刺激細胞導致應激損傷。
緩沖液：使用無菌的 D-Hank’s 液或 PBS（不含 Ca²?、Mg²?，避免影響胰酶活性），用于沖洗組織和終止消化。
二、組織分離與細胞接種：減少損傷，保證純度
原代 CFs 的分離質量直接決定后續(xù)培養(yǎng)效果，需注意以下細節(jié)：
1、組織取材與處理
選擇健康大鼠（如 SPF 級 SD 大鼠，6-8 周齡，避免老年大鼠組織纖維化嚴重導致細胞活性低），處死后勤快取出眼球，用 75% 乙醇快速擦拭眼球表面（≤30 秒，避免乙醇滲透損傷脈絡膜），再用無菌 D-Hank’s 液沖洗 3 次。
在解剖顯微鏡下小心剝離脈絡膜（避免混入視網(wǎng)膜、鞏膜組織，這些組織中的細胞會污染 CFs，如視網(wǎng)膜色素上皮細胞會與 CFs 競爭生長），將脈絡膜剪成 1mm³ 以下的小塊（組織塊越小，細胞越易遷出），用 D-Hank’s 液沖洗 2-3 次去除殘留血液和雜質。
2、消化與接種技巧
消化時將組織塊加入預溫的胰酶，37℃孵育 15-20 分鐘，期間每隔 5 分鐘輕輕震蕩 1 次，觀察組織塊邊緣是否變模糊（避免過度消化導致細胞裂解）；消化后立即加入 2-3 倍體積的含血清培養(yǎng)基終止胰酶活性，用吸管輕輕吹打組織塊（力度適中，避免產(chǎn)生氣泡損傷細胞），使細胞分散。
用 200 目細胞篩過濾細胞懸液（去除未消化的組織碎片，減少雜質污染），1000rpm 離心 5 分鐘（低速離心避免細胞破裂），棄上清后用新鮮培養(yǎng)基重懸細胞，計數(shù)后按1×10?-2×10?個細胞 /cm²的密度接種（密度過低易導致細胞貼壁困難，密度過高易出現(xiàn)接觸抑制），接種后輕輕搖晃培養(yǎng)皿使細胞均勻分布，放入培養(yǎng)箱靜置 24 小時（期間不移動培養(yǎng)皿，保證細胞充分貼壁）。
三、培養(yǎng)維護：精準控制環(huán)境，避免污染與應激
原代 CFs 貼壁后需精細化維護，重點關注“換液、傳代、污染防控”：
1、換液頻率與操作
接種后24-48 小時首次換液：此時細胞已初步貼壁，需棄去未貼壁的死細胞、殘留胰酶和組織碎片，加入新鮮培養(yǎng)基（避免舊培養(yǎng)基中積累的代謝廢物抑制細胞生長）。
后續(xù)換液：根據(jù)培養(yǎng)基顏色變化（當培養(yǎng)基由紅色變?yōu)槌赛S色，提示 pH 下降、代謝廢物增多），每 2-3 天換液 1 次；換液時用無菌 PBS 輕輕沖洗細胞表面 1 次（避免直接沖淋細胞導致脫落），加入培養(yǎng)基時沿培養(yǎng)皿壁緩慢注入（避免產(chǎn)生水流沖擊細胞）。
2、傳代時機與方法
傳代時機：當細胞融合度達到 70%-80% 時進行傳代（避免融合度過高導致接觸抑制，細胞停止增殖），原代 CFs 通常培養(yǎng) 5-7 天達到傳代標準，且傳代次數(shù)有限（一般不超過 5 代，超過后細胞易出現(xiàn)衰老、形態(tài)改變或功能喪失）。
傳代操作：棄去培養(yǎng)基，加入預溫的胰酶覆蓋細胞表面，37℃孵育 3-5 分鐘，在顯微鏡下觀察到細胞收縮變圓、間隙增大時，立即加入培養(yǎng)基終止消化；用吸管輕輕吹打細胞（從培養(yǎng)皿邊緣向中心螺旋式吹打，避免遺漏角落細胞），制成單細胞懸液后按 1:2 或 1:3 的比例接種到新培養(yǎng)皿（傳代比例過高會導致細胞密度過低，生長緩慢）。
3、污染防控重點
支原體污染：支原體是原代細胞最常見的隱性污染（肉眼不可見，會抑制細胞增殖、改變細胞功能），需每 2 周用支原體檢測試劑盒檢測 1 次；若發(fā)現(xiàn)污染，需立即丟棄污染細胞（支原體難以徹底清除，避免交叉污染其他細胞），并對培養(yǎng)箱、耗材進行徹底消毒。
細菌 / 真菌污染：若培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁（細菌污染）或白色 / 黑色斑點（真菌污染），需立即將污染細胞移出培養(yǎng)室，用含 2% 次氯酸鈉的溶液擦拭培養(yǎng)箱內(nèi)壁，并用無菌空氣凈化培養(yǎng)箱；日常操作中避免將瓶口長時間暴露，移液時槍頭不觸碰瓶口和臺面。
細胞交叉污染：不同細胞系（如同時培養(yǎng)視網(wǎng)膜細胞）需分開操作，使用專用的耗材和試劑，避免共用移液槍或培養(yǎng)皿導致交叉污染。
四、質量監(jiān)控：確保細胞純度與功能
原代 CFs 需通過檢測確認純度和活性，避免雜細胞影響實驗結果：
1、細胞形態(tài)觀察
每日在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)：正常 CFs 呈長梭形或多邊形，貼壁生長，排列呈“漩渦狀”；若出現(xiàn)圓形細胞增多（細胞凋亡）、形態(tài)不規(guī)則（應激損傷）或雜質細胞（如上皮細胞呈多邊形、緊密排列），需分析原因（如血清質量、污染、消化過度）并及時調整。
2、純度鑒定
采用免疫熒光染色檢測成纖維細胞特異性標志物：波形蛋白陽性（成纖維細胞標志物），角蛋白陰性（上皮細胞標志物）、CD31 陰性（血管內(nèi)皮細胞標志物），確保 CFs 純度≥95%（雜細胞過多會干擾實驗結果，如研究 CFs 在脈絡膜新生血管中的作用時，內(nèi)皮細胞污染會導致結果誤判）。
3、活性與功能檢測
用臺盼藍染色法檢測細胞活性（活性≥90% 為合格）；若需用于功能實驗（如細胞因子分泌、增殖能力檢測），需在傳代 2-3 代時進行（此時細胞狀態(tài)最佳，衰老細胞少），避免使用傳代次數(shù)過多的細胞。
五、特殊注意事項
避免頻繁操作：原代 CFs 對環(huán)境變化敏感，避免頻繁觀察或移動培養(yǎng)皿（會導致溫度波動和細胞震動，影響貼壁和增殖）。
凍存與復蘇：若需長期保存，需在細胞融合度 70%-80% 時凍存（凍存液為培養(yǎng)基：FBS:DMSO=7:2:1，DMSO 需緩慢加入避免細胞毒性），-80℃保存≤1 個月，長期需轉入液氮；復蘇時快速 37℃水浴融化（1-2 分鐘），立即加入培養(yǎng)基稀釋 DMSO，離心后重懸接種（復蘇后細胞活性會下降，需額外添加 bFGF 促進恢復）。
實驗記錄：詳細記錄每一步操作（如大鼠品系、取材時間、血清批次、傳代次數(shù)、檢測結果），便于追溯實驗差異的原因。
總之，原代
大鼠脈絡膜成纖維細胞的培養(yǎng)核心是“無菌環(huán)境 + 溫和操作 + 精準監(jiān)控”，需從試劑、操作、環(huán)境等多維度減少細胞損傷和污染，才能保證細胞的純度、活性和功能穩(wěn)定性，為后續(xù)的眼部生理（如脈絡膜結構維持）或病理（如脈絡膜新生血管）研究提供可靠的細胞模型。
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