厭氧菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作流程中需要關(guān)注的注意事項(xiàng)有哪些？
小楊 / 2025-09-02 10:04:57
百歐博偉生物：厭氧菌分離培養(yǎng)的成功與否高度依賴對“無氧環(huán)境”“標(biāo)本質(zhì)量”和“操作細(xì)節(jié)”的把控，以下是標(biāo)準(zhǔn)操作流程中需特別關(guān)注的注意事項(xiàng)，涵蓋全流程關(guān)鍵控制點(diǎn)：
一、厭氧環(huán)境維持的注意事項(xiàng)
1、環(huán)境參數(shù)的實(shí)時(shí)監(jiān)控
厭氧工作站需每日監(jiān)測氣體比例（85% N?+10% H?+5% CO?）和溫度（35-37℃），若 H?濃度不足（<8%），需及時(shí)補(bǔ)充，避免催化劑（鈀）失效（表現(xiàn)為亞甲藍(lán)指示劑變藍(lán)）。
厭氧罐使用前需檢查：產(chǎn)氣包是否在有效期內(nèi)，催化劑是否受潮（受潮會失去除氧能力，可 160℃干烤 2 小時(shí)復(fù)活），密封是否嚴(yán)密（倒置 10 秒無氣體泄漏）。
避免頻繁開關(guān)工作站門：每次開門時(shí)間≤30 秒，開門后需等待 30 分鐘，待氣體重新平衡、氧濃度 < 0.1% 后再操作，防止短期氧暴露影響細(xì)菌活性。
2、培養(yǎng)基的預(yù)還原與保存
預(yù)還原后的培養(yǎng)基需在厭氧環(huán)境中保存，有效期≤7 天（超過則可能重新氧化，表面形成氧化層），使用前觀察顏色：含還原劑的培養(yǎng)基若變?yōu)闇\棕色，提示氧化，需重新處理。
傾注平板時(shí)避免產(chǎn)生氣泡：氣泡內(nèi)的氧氣會局部破壞無氧環(huán)境，倒平板后需在工作站內(nèi)靜置 30 分鐘，待瓊脂凝固且表面無氣泡后使用。
二、標(biāo)本采集與轉(zhuǎn)運(yùn)的禁忌與要點(diǎn)
1、絕對避免的錯誤采集方式
不可用棉簽采集標(biāo)本：棉簽纖維易吸附氧氣，且無法有效隔絕空氣，導(dǎo)致厭氧菌在轉(zhuǎn)運(yùn)中失活（尤其對氧敏感的普雷沃菌、梭桿菌）。
穿刺液標(biāo)本不可先注入普通試管再轉(zhuǎn)移：普通試管無還原環(huán)境，標(biāo)本接觸空氣時(shí)間 > 5 分鐘即可能導(dǎo)致脆弱類桿菌等嚴(yán)格厭氧菌死亡。
2、轉(zhuǎn)運(yùn)中的“時(shí)間與溫度”紅線
標(biāo)本從采集到進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室厭氧環(huán)境的總時(shí)間必須≤2 小時(shí)：超過則需記錄延遲原因，結(jié)果解讀時(shí)需考慮厭氧菌活性下降的影響。
嚴(yán)禁冷藏（4℃）或冷凍（-20℃）轉(zhuǎn)運(yùn)：低溫會抑制厭氧菌的代謝酶活性，尤其對放線菌、雙歧桿菌等影響顯著，室溫（20-25℃）是唯一可選條件。
三、實(shí)驗(yàn)室操作的細(xì)節(jié)規(guī)范
1、接種環(huán)節(jié)的“防氧”要求
液體標(biāo)本離心時(shí)需用密封離心管：普通試管離心會導(dǎo)致空氣混入沉淀，需在工作站內(nèi)打開離心管，避免離心后暴露氧氣。
組織標(biāo)本研磨需在預(yù)還原生理鹽水中進(jìn)行：研磨過程會產(chǎn)生氣泡，需在工作站內(nèi)操作，研磨后立即接種（不可放置超過 10 分鐘）。
2、培養(yǎng)觀察的“無氧原則”
觀察菌落必須在工作站內(nèi)進(jìn)行：禁止將平板移出工作站查看（即使短暫暴露，也可能導(dǎo)致邊緣菌落因氧暴露死亡），可通過工作站觀察窗記錄形態(tài)。
延長培養(yǎng)的平板需補(bǔ)充水分：培養(yǎng)超過 7 天時(shí)，培養(yǎng)基易干燥，需在工作站內(nèi)用無菌滴管滴加少量預(yù)還原生理鹽水（每平板 3-5 滴），避免菌落干裂。
四、質(zhì)量控制與安全的核心要點(diǎn)
1、陽性對照的必要性
2、生物安全的特殊要求
處理
破傷風(fēng)梭菌、
肉毒梭菌等致病性厭氧菌時(shí)，需在生物安全柜內(nèi)完成標(biāo)本開封（再移入工作站），避免芽胞氣溶膠污染。
廢棄標(biāo)本需高壓滅菌 2 次：首次滅菌后可能因芽胞未被殺滅復(fù)活，需間隔 2 小時(shí)再次滅菌（121℃，30 分鐘），確保徹底滅活。
總結(jié)：厭氧菌分離培養(yǎng)的核心是構(gòu)建“全程無氧鏈”，任何環(huán)節(jié)的氧暴露（即使幾秒）或操作不規(guī)范（如標(biāo)本污染、培養(yǎng)基氧化）都可能導(dǎo)致培養(yǎng)失敗。嚴(yán)格遵循上述注意事項(xiàng)，可顯著提高厭氧菌的分離率和鑒定準(zhǔn)確性。
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