弧菌分離培養(yǎng)基的使用注意事項(xiàng)有哪些？體現(xiàn)在哪些方面？
小楊 / 2025-09-20 09:24:45
弧菌分離培養(yǎng)基的使用需嚴(yán)格把控配制、滅菌、接種、培養(yǎng)及生物安全等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，核心是確保培養(yǎng)基有效性和操作安全性，避免污染或漏檢。
一、培養(yǎng)基配制與滅菌注意事項(xiàng)
1、成分精準(zhǔn)稱量與溶解
需嚴(yán)格按配方比例稱量各成分，尤其是氯化鈉、膽鹽、抑菌劑等關(guān)鍵成分，其濃度直接影響弧菌選擇性（如高鹽環(huán)境是弧菌生長的必要條件）。
溶解時建議用純化水或蒸餾水，加熱過程中需不斷攪拌，避免成分沉淀，確保所有成分完全溶解后再校正 pH。
2、pH 值嚴(yán)格校正
多數(shù)弧菌（如霍亂弧菌）偏好堿性環(huán)境，培養(yǎng)基 pH 需精準(zhǔn)控制在8.4-8.6（如堿性瓊脂、慶大霉素瓊脂）。若 pH 偏低，可能抑制弧菌生長；pH 過高則會導(dǎo)致非目標(biāo)菌過度繁殖。
校正 pH 時需在培養(yǎng)基冷卻至 40-50℃時進(jìn)行，避免高溫下 pH 計探頭損壞，且校正后需攪拌均勻。
3、滅菌條件規(guī)范
常規(guī)采用121℃高壓蒸汽滅菌 15-20 分鐘，滅菌時間和溫度需嚴(yán)格把控：時間過短可能導(dǎo)致滅菌不徹底，引入雜菌；時間過長或溫度過高，會破壞培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分（如酵母粉、蛋白胨）和抑菌劑活性。
含抑菌劑或顯色劑的培養(yǎng)基，需在滅菌后冷卻至 50-55℃ 時再加入，避免高溫破壞藥效或顯色效果，加入后需迅速搖勻并傾注平板。
二、平板制備與儲存注意事項(xiàng)
1、平板傾注與凝固
滅菌后的培養(yǎng)基需趁熱傾注（避免凝固），每個平板傾注量控制在15-20ml，確保厚度均勻（過薄易干裂，過厚影響菌落生長）。
傾注時需避免產(chǎn)生氣泡，若有氣泡可輕輕刮除；凝固過程中需保持平板水平，防止培養(yǎng)基厚薄不均，凝固后需倒置放置（避免冷凝水滴落污染表面）。
2、儲存條件與有效期
制備好的平板需密封后置于2-8℃冰箱避光儲存，不同培養(yǎng)基有效期不同：
TCBS 瓊脂、弧菌顯色培養(yǎng)基建議 7 天內(nèi)使用，堿性瓊脂可延長至 14 天。
儲存期間需定期檢查：若平板出現(xiàn)干裂、霉斑、顏色異常（如 TCBS 瓊脂由綠色變?yōu)辄S色），或表面有冷凝水過多的情況，需立即丟棄，不可使用。
三、樣本接種與培養(yǎng)注意事項(xiàng)
1、樣本處理與接種方法
樣本（如糞便、水產(chǎn)品、水體）需新鮮處理，若不能立即接種，需置于無菌容器中冷藏（2-8℃），且冷藏時間不超過 24 小時，避免弧菌失活。
接種時需采用分區(qū)劃線法（從高濃度到低濃度逐步稀釋），確保形成單菌落，便于后續(xù)鑒定；劃線工具（如接種環(huán)）需灼燒滅菌并冷卻后使用，避免高溫殺死樣本中的弧菌。
2、培養(yǎng)環(huán)境嚴(yán)格控制
弧菌為需氧或兼性厭氧菌，需在35-37℃有氧環(huán)境（如普通培養(yǎng)箱）中培養(yǎng)，培養(yǎng)時間根據(jù)培養(yǎng)基類型調(diào)整：TCBS 瓊脂需 18-24 小時，堿性膽鹽瓊脂需 16-18 小時，不可過長（避免菌落過度生長融合，影響觀察）。
部分弧菌（如
副溶血性弧菌）需高鹽環(huán)境，培養(yǎng)過程中需確保培養(yǎng)基中的鹽分不流失（如培養(yǎng)箱內(nèi)避免過度干燥），否則可能導(dǎo)致菌落生長不良。
四、結(jié)果觀察與生物安全注意事項(xiàng)
1、菌落觀察與鑒別
培養(yǎng)后需根據(jù)培養(yǎng)基特性判斷目標(biāo)菌落：如
TCBS 瓊脂上，霍亂弧菌為黃色菌落，副溶血性弧菌為綠色菌落；弧菌顯色培養(yǎng)基上，副溶血性弧菌為品紅色菌落。需排除雜菌干擾（如
大腸菌群在 TCBS 瓊脂上不生長或生長微弱）。
若未觀察到目標(biāo)菌落，需排查原因：樣本是否新鮮、培養(yǎng)基是否失效、培養(yǎng)條件是否正確，必要時重新接種。
2、生物安全嚴(yán)格把控
弧菌（尤其是霍亂弧菌）屬于致病性微生物，操作需在生物安全二級（BSL-2）實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，操作人員需穿戴防護(hù)服、手套、口罩，避免樣本接觸皮膚或吸入氣溶膠。
實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，所有污染的器具（如接種環(huán)、培養(yǎng)皿）需經(jīng)121℃高壓滅菌 30 分鐘后再清洗或丟棄；實(shí)驗(yàn)臺面需用含氯消毒劑擦拭消毒，避免交叉污染。
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