羊原代肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)過程中需要注意哪些細(xì)節(jié)？
小楊 / 2025-12-08 09:35:39
羊原代肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（Sheep Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells, SPASMCs）的培養(yǎng)核心是模擬體內(nèi)生理微環(huán)境、減少污染風(fēng)險(xiǎn)、維持細(xì)胞原代特性，其細(xì)節(jié)貫穿“組織分離 - 原代接種 - 傳代培養(yǎng) - 凍存復(fù)蘇”全流程。以下是關(guān)鍵注意事項(xiàng)，結(jié)合原代細(xì)胞脆弱性和平滑肌細(xì)胞特異性展開：
一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：無菌環(huán)境與試劑優(yōu)化
1、無菌操作核心細(xì)節(jié)
環(huán)境消毒：超凈工作臺(tái)需提前 30 分鐘紫外消毒，操作前用 75% 乙醇擦拭臺(tái)面及器械（剪刀、鑷子、培養(yǎng)皿等需高壓滅菌并烘干）；實(shí)驗(yàn)人員需戴無菌手套、口罩，避免交談或手部接觸非無菌區(qū)域。
試劑無菌驗(yàn)證：
培養(yǎng)基（推薦專用原代平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)基，或 DMEM/F12+10% 胎牛血清 FBS+1% 雙抗 + 平滑肌細(xì)胞生長因子）需提前 37℃水浴復(fù)溫，避免低溫刺激細(xì)胞；
胰酶（0.25% 胰酶 - EDTA）、PBS 需過濾除菌，使用前檢查是否有渾濁、沉淀（若出現(xiàn)污染跡象立即丟棄）；
FBS 需選擇低內(nèi)毒素（<10 EU/mL）、批號(hào)穩(wěn)定的產(chǎn)品，首次使用前需做細(xì)胞毒性驗(yàn)證（接種后觀察 24-48 小時(shí)細(xì)胞貼壁及增殖情況）。
2、器械與耗材處理
解剖器械（眼科剪、止血鉗）需鋒利，避免反復(fù)擠壓組織導(dǎo)致細(xì)胞損傷；使用前用 PBS 沖洗 2-3 次，去除殘留滅菌劑。
培養(yǎng)瓶/皿需預(yù)涂細(xì)胞外基質(zhì)（如明膠 0.1%、膠原 Ⅰ 型），37℃孵育 1 小時(shí)后吸棄，增強(qiáng)平滑肌細(xì)胞貼壁能力（原代細(xì)胞貼壁依賴基質(zhì)信號(hào)）。
二、組織分離與原代接種：減少細(xì)胞損傷 + 提高存活率
1、肺動(dòng)脈組織獲取與處理
組織新鮮度：羊只處死后需在 30 分鐘內(nèi)取肺動(dòng)脈組織（優(yōu)先選擇肺動(dòng)脈主干或近端分支，避免遠(yuǎn)端細(xì)小血管含雜細(xì)胞過多），立即放入預(yù)冷的 PBS（含雙抗）中，冰上運(yùn)輸，減少細(xì)胞缺氧損傷。
去除雜組織：在無菌培養(yǎng)皿中用 PBS 沖洗組織 3-5 次，去除表面血液、脂肪、結(jié)締組織（雜組織會(huì)釋放抑制因子，影響平滑肌細(xì)胞增殖）；用眼科剪將組織剪至 1mm³ 以下的碎塊（越小越好，增加細(xì)胞游離面積）。
2、消化條件精準(zhǔn)控制（原代分離關(guān)鍵）
酶解體系優(yōu)化：
采用“膠原酶 + 胰酶”聯(lián)合消化法：將組織碎塊加入含 0.1% 膠原酶 Ⅰ 型 + 0.05% 胰酶的消化液中，37℃恒溫?fù)u床（50-80 rpm）消化 1-2 小時(shí)，期間每 15 分鐘輕輕吹打 1 次，避免劇烈震蕩導(dǎo)致細(xì)胞破裂。
消化終點(diǎn)判斷：當(dāng)組織塊大部分分散、溶液出現(xiàn)輕微渾濁時(shí)，立即加入 2 倍體積含 10% FBS 的培養(yǎng)基終止消化（FBS 可抑制胰酶活性，避免過度消化）。
細(xì)胞過濾與離心：
用 200 目細(xì)胞篩過濾消化液，去除未消化的組織碎片；
1000 rpm 離心 5 分鐘（低速離心，避免細(xì)胞沉淀受壓損傷），棄上清后用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)后接種（接種密度控制在 5×10?-1×10? cells/cm²，密度過低難以貼壁，過高易導(dǎo)致污染）。
3、原代接種后培養(yǎng)
接種后將培養(yǎng)瓶置于 37℃、5% CO?培養(yǎng)箱（濕度≥95%），前 24 小時(shí)不移動(dòng)培養(yǎng)瓶（讓細(xì)胞充分吸附到基質(zhì)上），避免頻繁開關(guān)培養(yǎng)箱導(dǎo)致溫度/CO?濃度波動(dòng)。
24 小時(shí)后首次換液，去除未貼壁的死細(xì)胞、雜質(zhì)；后續(xù)每 2-3 天換液 1 次，換液時(shí)沿培養(yǎng)瓶壁緩慢加入培養(yǎng)基，避免沖擊貼壁細(xì)胞。
三、傳代培養(yǎng)：維持細(xì)胞表型 + 避免過度增殖
1、傳代時(shí)機(jī)與密度
當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá) 80%-90% 時(shí)及時(shí)傳代（平滑肌細(xì)胞過度密集會(huì)導(dǎo)致接觸抑制，出現(xiàn)形態(tài)異常、增殖停滯）；若融合度超過 95%，需立即消化，否則細(xì)胞易脫落或出現(xiàn)分化。
傳代比例控制在 1:2-1:3（原代細(xì)胞分裂能力有限，比例過高會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞密度不足，貼壁困難；比例過低易導(dǎo)致營養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)），前 3 代盡量保持 1:2 傳代，維持細(xì)胞活性。
2、消化操作細(xì)節(jié)
消化前用 PBS 沖洗細(xì)胞 2 次，去除殘留血清（血清會(huì)抑制胰酶活性，導(dǎo)致消化不完全）；
加入適量胰酶（覆蓋細(xì)胞層即可），37℃孵育 1-2 分鐘，期間在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)：當(dāng)細(xì)胞從長梭狀變?yōu)閳A形、開始脫落時(shí)，立即加入含 FBS 的培養(yǎng)基終止消化；
用移液管輕輕吹打培養(yǎng)瓶壁（重點(diǎn)吹打瓶底邊緣，細(xì)胞易殘留此處），吹打次數(shù)控制在 10-15 次，避免用力過猛導(dǎo)致細(xì)胞破裂（原代平滑肌細(xì)胞細(xì)胞膜較脆弱）。
3、細(xì)胞表型維持
避免使用高糖培養(yǎng)基（高糖會(huì)誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化為合成型，失去收縮功能），優(yōu)先選擇低糖 DMEM/F12 或?qū)Ｓ门囵B(yǎng)基；
傳代過程中避免反復(fù)胰酶消化（每次消化時(shí)間不超過 2 分鐘），過度消化會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞表面抗原丟失，影響 α-SMA（平滑肌特異性標(biāo)志物）表達(dá)；
培養(yǎng)體系中可添加 10 ng/mL 血管緊張素 Ⅱ（AngⅡ）或 5 ng/mL 血小板衍生生長因子（PDGF），維持平滑肌細(xì)胞的收縮表型和增殖活性。
四、污染防控：原代培養(yǎng)重中之重
1、細(xì)菌/真菌污染預(yù)防
組織分離時(shí)嚴(yán)格無菌操作，避免土壤、皮膚表面微生物污染；若操作時(shí)間較長（超過 1 小時(shí)），可在培養(yǎng)基中臨時(shí)添加雙倍雙抗（2% 青霉素 - 鏈霉素），傳代后恢復(fù)正常濃度。
定期觀察細(xì)胞形態(tài)：若培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁、變黃速度過快，或細(xì)胞周圍出現(xiàn)顆粒狀沉淀、絲狀真菌，立即丟棄污染瓶，并用 75% 乙醇擦拭培養(yǎng)箱內(nèi)部，避免交叉污染。
2、支原體污染防控
原代細(xì)胞支原體污染率較高，建議每 3 代檢測(cè) 1 次（采用 PCR 法或支原體檢測(cè)試劑盒）；
若發(fā)現(xiàn)支原體污染，可使用支原體清除劑處理，連續(xù)培養(yǎng) 2 代后檢測(cè)，確認(rèn)陰性后再繼續(xù)傳代（避免清除劑殘留損傷細(xì)胞）。
3、雜細(xì)胞污染去除
肺動(dòng)脈組織分離時(shí)可能混入內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞，可通過以下方法純化：
差速貼壁法：接種后 2 小時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞貼壁速度快于平滑肌細(xì)胞，此時(shí)吸棄培養(yǎng)基，重新加入新鮮培養(yǎng)基，可去除大部分內(nèi)皮細(xì)胞；
免疫磁珠分選法：用 α-SMA 抗體標(biāo)記磁珠，分選陽性細(xì)胞（純度可達(dá) 95% 以上），適用于對(duì)細(xì)胞純度要求高的實(shí)驗(yàn)（如信號(hào)通路研究）。
五、凍存與復(fù)蘇：減少細(xì)胞活性損失
1、凍存細(xì)節(jié)
凍存時(shí)機(jī)：選擇對(duì)數(shù)期細(xì)胞（融合度 70%-80%），此時(shí)細(xì)胞活性最高；凍存前 1 天換液 1 次，確保細(xì)胞營養(yǎng)充足。
凍存液配方：90% FBS+10% DMSO（DMSO 需選擇細(xì)胞級(jí)，提前預(yù)冷），避免使用含血清替代品的凍存液（原代細(xì)胞對(duì)滲透壓敏感）；
凍存程序：采用“梯度降溫”，4℃孵育 30 分鐘→-20℃孵育 2 小時(shí)→-80℃過夜→轉(zhuǎn)入液氮長期保存（避免直接放入液氮，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰破裂）。
2、復(fù)蘇細(xì)節(jié)
復(fù)蘇時(shí)快速解凍：將凍存管從液氮中取出，立即放入 37℃水浴鍋，輕輕搖晃至完全融化（1-2 分鐘內(nèi)完成，避免 DMSO 長時(shí)間暴露導(dǎo)致細(xì)胞毒性）；
離心洗滌：融化后立即加入 10 倍體積預(yù)溫的培養(yǎng)基，1000 rpm 離心 5 分鐘，棄上清（去除殘留 DMSO），用培養(yǎng)基重懸后接種；
復(fù)蘇后培養(yǎng)：24 小時(shí)內(nèi)不換液，讓細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境，48 小時(shí)后換液，觀察細(xì)胞貼壁及增殖情況（原代細(xì)胞復(fù)蘇存活率較低，約 50%-70%，需適當(dāng)提高接種密度）。
六、細(xì)胞質(zhì)量監(jiān)測(cè)與常見問題排查
1、質(zhì)量監(jiān)測(cè)指標(biāo)
形態(tài)學(xué)：正常 SPASMCs 為長梭狀、排列呈“峰谷狀”，若出現(xiàn)多邊形、貼壁松散，可能是表型轉(zhuǎn)化或污染；
特異性鑒定：α-SMA 免疫熒光染色陽性率≥90%（原代細(xì)胞純度標(biāo)準(zhǔn)），若陽性率過低，需重新純化；
增殖活性：每代細(xì)胞倍增時(shí)間約 24-48 小時(shí)，若倍增時(shí)間延長，可能是培養(yǎng)基營養(yǎng)不足或細(xì)胞老化。
2、常見問題排查
細(xì)胞貼壁差：①培養(yǎng)皿未預(yù)涂基質(zhì)→重新涂明膠/膠原；②血清質(zhì)量差→更換高活性 FBS；③消化過度→縮短胰酶孵育時(shí)間；
細(xì)胞增殖緩慢：①培養(yǎng)基缺乏生長因子→添加 PDGF/AngⅡ；②培養(yǎng)環(huán)境 CO?濃度異常（正常 5%）→校準(zhǔn)培養(yǎng)箱；③細(xì)胞代次過高（原代細(xì)胞建議使用 1-5 代）→重新分離原代；
細(xì)胞形態(tài)異常：①污染→檢測(cè)支原體/細(xì)菌，及時(shí)丟棄；②滲透壓異常→檢查培養(yǎng)基配方，避免高糖/高鹽；③傳代比例不當(dāng)→調(diào)整為 1:2 傳代，避免過度密集。
七、其他注意事項(xiàng)
避免頻繁觀察：培養(yǎng)期間每天觀察 1 次即可，頻繁將培養(yǎng)瓶取出培養(yǎng)箱，會(huì)導(dǎo)致溫度、CO?濃度波動(dòng)，影響細(xì)胞生長；
試劑一致性：實(shí)驗(yàn)全程使用同一批號(hào)的培養(yǎng)基、血清、胰酶，避免因試劑差異導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)波動(dòng)；
安全操作：羊組織可能攜帶病原體，操作時(shí)需穿實(shí)驗(yàn)服、戴手套，實(shí)驗(yàn)后及時(shí)處理廢棄物，避免交叉感染。
通過以上細(xì)節(jié)控制，可有效提高
羊原代肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的存活率、純度和穩(wěn)定性，為后續(xù)肺動(dòng)脈高壓發(fā)病機(jī)制、藥物篩選等實(shí)驗(yàn)提供可靠的細(xì)胞模型。
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