致瀉大腸埃希氏菌增菌與分離的關(guān)鍵步驟與操作流程！
小楊 / 2025-12-29 09:48:02
致瀉大腸埃希氏菌（Enterotoxigenic E. coli, ETEC）的增菌與分離是食品微生物學(xué)和臨床微生物學(xué)中的關(guān)鍵步驟。以下是詳細的實驗方案，涵蓋了從樣本處理到最終鑒定的全過程。
一、樣本處理與前增菌（Enrichment）
增菌的目的是讓目標菌在營養(yǎng)豐富的環(huán)境中大量繁殖，以便后續(xù)的選擇性分離。
1、選擇合適的增菌培養(yǎng)基
首選：緩沖蛋白胨水 (Buffered Peptone Water, BPW)。
作用：提供基礎(chǔ)營養(yǎng)，維持 pH 穩(wěn)定，為細菌生長提供良好環(huán)境。
配方要點：蛋白胨、牛肉浸粉、葡萄糖、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀。
次選/特殊情況：
GN 增菌液 (Gram-Negative Enrichment Broth)：適用于腸道致病菌的增菌，可抑制某些革蘭氏陽性菌。
EC 肉湯 (Escherichia coli Broth)：專為
大腸埃希氏菌設(shè)計的增菌培養(yǎng)基，含有乳糖、膽鹽等成分。
2、操作步驟
取樣：按照標準操作程序（SOP），從待測樣品（如食品、臨床樣本）中取樣。
接種：將樣品均勻接種到 BPW 等增菌培養(yǎng)基中。接種量通常為樣品重量或體積的 10%。
培養(yǎng)：
溫度：36°C ± 1°C。
時間：18-24 小時。
氣體環(huán)境：需氧培養(yǎng)。
二、選擇性分離培養(yǎng)（Selective Isolation）
這一步的核心是使用含有抑制劑的選擇性培養(yǎng)基，抑制雜菌生長，同時允許目標菌生長。
1、選擇合適的選擇性培養(yǎng)基
首選：麥康凱瓊脂 (MacConkey Agar, MAC)。
作用：
選擇性：膽鹽和結(jié)晶紫抑制革蘭氏陽性菌生長。
鑒別性：乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸，使指示劑（中性紅）變色。
觀察：
大腸埃希氏菌因發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，形成紅色或粉紅色、圓形、濕潤、凸起的菌落。
次選/補充：
伊紅美藍瓊脂 (Eosin Methylene Blue Agar, EMB)：
作用：伊紅和美藍為指示劑，
大腸埃希氏菌發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸后，與指示劑結(jié)合形成紫黑色并有金屬光澤的菌落。
優(yōu)勢：對大腸埃希氏菌的鑒別性比 MAC 更強。
Hektoen Enteric Agar (HE)：適用于沙門氏菌和志賀氏菌的分離，但也能分離
大腸埃希氏菌。大腸埃希氏菌在此培養(yǎng)基上通常為黃色菌落。
2、操作步驟
接種：用無菌接種環(huán)或接種針，從增菌后的肉湯中挑取一環(huán)菌液，在 MAC 或 EMB 平板表面進行分區(qū)劃線，以獲得單個菌落。
培養(yǎng)：
溫度：36°C ± 1°C。
時間：18-24 小時。
氣體環(huán)境：需氧培養(yǎng)。
三、菌落形態(tài)觀察與生化鑒定
從分離平板上挑選典型菌落進行形態(tài)觀察和生化試驗，以確認其為大腸埃希氏菌。
1、典型菌落形態(tài)
MAC 平板：紅色或粉紅色，圓形，邊緣整齊，表面光滑，濕潤。
EMB 平板：紫黑色，有金屬光澤。
2、關(guān)鍵生化試驗（API 20E 系統(tǒng)或生化管）
生化試驗 結(jié)果 說明
革蘭氏染色 陰性 短桿狀，無芽孢，通常成對或短鏈排列。
乳糖發(fā)酵 陽性 產(chǎn)酸（可使指示劑變色）。
吲哚試驗 (Indole) 陽性 產(chǎn)生吲哚。
甲基紅試驗 (Methyl Red) 陽性 產(chǎn)生大量混合酸。
VP 試驗 (Voges-Proskauer) 陰性 不產(chǎn)生乙酰甲基甲醇。
枸櫞酸鹽利用 陰性 不能利用枸櫞酸鹽作為唯一碳源。
脲酶試驗 陰性 不產(chǎn)生脲酶。
注意：
致瀉大腸埃希氏菌（ETEC）的生化特性通常與普通大腸埃希氏菌一致，主要區(qū)別在于其是否攜帶產(chǎn)生腸毒素的質(zhì)粒。因此，生化試驗只能證明其為大腸埃希氏菌，不能直接證明其致病性。
四、血清學(xué)鑒定（可選但推薦）
血清學(xué)鑒定可以確認菌株的血清型，對于溯源和流行病學(xué)調(diào)查非常重要。
方法：采用玻片凝集試驗 (Slide Agglutination Test)。
原理：使用針對大腸埃希氏菌 O 抗原（菌體抗原）和 H 抗原（鞭毛抗原）的特異性診斷血清。
操作：將菌落混懸于生理鹽水中，滴加相應(yīng)的診斷血清，觀察是否出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。
結(jié)果：出現(xiàn)凝集則為陽性，表明該菌株屬于該血清型。
五、腸毒素檢測（確認致病性）
這是區(qū)分致病性大腸埃希氏菌和非致病性菌株的關(guān)鍵步驟。
1、耐熱腸毒素 (ST)
檢測方法：乳鼠灌胃試驗或酶聯(lián)免疫吸附試驗 (ELISA)。
原理：ST 對熱穩(wěn)定，能引起實驗動物（如乳鼠）的腹瀉和嘔吐。
2、不耐熱腸毒素 (LT)
檢測方法：兔腸段結(jié)扎試驗或細胞毒性試驗。
原理：LT 對熱不穩(wěn)定，能引起兔腸段液體積聚或?qū)е?Vero 細胞病變。
六、總結(jié)流程
樣本 → 前增菌 (BPW, 36°C, 18-24h) → 選擇性分離 (MAC/EMB, 36°C, 18-24h) → 挑取典型菌落 → 生化鑒定 (確認是大腸埃希氏菌) → 血清學(xué)鑒定 (確定血清型) → 腸毒素檢測 (確認致病性) → 報告結(jié)果
關(guān)鍵注意事項
無菌操作：整個實驗過程必須嚴格遵守?zé)o菌操作規(guī)范，防止樣品污染和操作者感染。
培養(yǎng)基質(zhì)量：使用質(zhì)量合格、在有效期內(nèi)的培養(yǎng)基。
培養(yǎng)條件：嚴格控制培養(yǎng)溫度和時間，這對細菌的生長和生化反應(yīng)結(jié)果至關(guān)重要。
安全防護：由于涉及致病菌，所有實驗操作都應(yīng)在生物安全二級（BSL-2）或更高等級的實驗室中進行，并佩戴適當?shù)膫€人防護裝備（PPE）。
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