小鼠腎上腺皮質(zhì)瘤細(xì)胞的培養(yǎng)過程中需要注意哪些事項(xiàng)？
小楊 / 2026-01-09 09:18:08
小鼠腎上腺皮質(zhì)瘤細(xì)胞（Y1 細(xì)胞）的培養(yǎng)需重點(diǎn)關(guān)注貼壁特性、激素敏感性及污染防控，以下是分環(huán)節(jié)的注意事項(xiàng)：
一、復(fù)蘇環(huán)節(jié)注意事項(xiàng)
凍存管需快速放入 37℃水浴鍋中，1-2 min 內(nèi)完全融化，避免冰晶損傷細(xì)胞；融化后立即用含血清培養(yǎng)基稀釋，降低凍存液中二甲基亞砜（DMSO）的細(xì)胞毒性。
復(fù)蘇離心轉(zhuǎn)速控制在 1000 r/min、5 min，避免離心力過大損傷細(xì)胞；棄上清時動作輕柔，勿吸棄細(xì)胞沉淀。
接種后將培養(yǎng)瓶置于 37℃、5% CO?培養(yǎng)箱，24 h 內(nèi)不更換培養(yǎng)基，給細(xì)胞足夠的貼壁和適應(yīng)時間。
二、傳代環(huán)節(jié)注意事項(xiàng)
待細(xì)胞融合度達(dá)到 70%-80% 時進(jìn)行傳代，融合度過高會導(dǎo)致細(xì)胞接觸抑制，影響增殖活性；傳代比例建議 1:3-1:4，避免接種過密或過稀。
消化液選用 0.25% 胰蛋白酶 + 0.02% EDTA，消化前用 PBS 清洗細(xì)胞 2 次，去除血清殘留（血清會抑制胰酶活性）；消化時間控制在 37℃、2-3 min，鏡下觀察到細(xì)胞變圓、間隙增大時立即加入含血清培養(yǎng)基終止消化。
吹打細(xì)胞時使用巴氏吸管，動作輕柔且沿瓶壁方向，避免產(chǎn)生氣泡，防止機(jī)械力損傷細(xì)胞。
三、培養(yǎng)環(huán)境與培養(yǎng)基注意事項(xiàng)
培養(yǎng)基首選 Ham's F-12，需添加 10% 胎牛血清、1% 丙酮酸鈉及 1% 青霉素 - 鏈霉素雙抗；血清需選擇批次穩(wěn)定的產(chǎn)品，使用前可進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證細(xì)胞適應(yīng)性。
培養(yǎng)箱需定期校準(zhǔn)溫度和 CO?濃度，確保 37℃±0.5℃、5%CO? 的穩(wěn)定環(huán)境；培養(yǎng)箱內(nèi)保持一定濕度，避免培養(yǎng)基揮發(fā)過快導(dǎo)致滲透壓升高。
培養(yǎng)基更換頻率為 2-3 d /次，更換時沿培養(yǎng)瓶壁緩慢加入新培養(yǎng)基，避免直接沖擊貼壁細(xì)胞層。
四、污染防控注意事項(xiàng)
Y1 細(xì)胞對真菌和支原體污染敏感，操作前需對超凈工作臺進(jìn)行 30 min 紫外消毒，實(shí)驗(yàn)器械需高溫滅菌；操作人員需嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)范，避免手部和呼吸道污染。
定期對細(xì)胞進(jìn)行支原體檢測，若發(fā)現(xiàn)支原體污染，需立即使用支原體清除劑處理或丟棄污染細(xì)胞，防止交叉污染。
避免與其他細(xì)胞系在同一超凈工作臺操作，培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)基需做好清晰標(biāo)記，防止混淆。
五、凍存環(huán)節(jié)注意事項(xiàng)
凍存細(xì)胞需處于對數(shù)生長期，此時細(xì)胞活性最高；凍存液配比為 70% Ham's F-12 培養(yǎng)基 + 20% 胎牛血清 + 10% DMSO，現(xiàn)配現(xiàn)用，避免 DMSO 氧化。
凍存程序需遵循梯度降溫原則：4℃放置 30 min→-20℃放置 2 h→-80℃過夜→轉(zhuǎn)入液氮長期保存；嚴(yán)禁直接將凍存管放入液氮，防止溫差過大導(dǎo)致凍存管破裂。
六、功能特性維持注意事項(xiàng)
Y1 細(xì)胞具有分泌類固醇激素的功能，且對促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）敏感，若實(shí)驗(yàn)涉及激素分泌檢測，需避免培養(yǎng)基中添加外源激素，防止干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
長期培養(yǎng)的細(xì)胞可能出現(xiàn)表型漂移，建議每 20-30 代 重新復(fù)蘇凍存的低代次細(xì)胞，維持細(xì)胞的生物學(xué)特性穩(wěn)定。
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