兔原代大隱靜脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)過程中需要注意哪些事項？
小楊 / 2026-01-17 10:37:10
兔原代大隱靜脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)成功率較低，核心注意事項圍繞無菌操作、細胞活性保護、內(nèi)皮細胞特異性維持三個核心要點展開，具體可分為取材、分離、培養(yǎng)、傳代、鑒定五個環(huán)節(jié)：
一、取材環(huán)節(jié)注意事項
實驗兔需選擇健康成年個體，體重 2.0-2.5kg 為宜，取材前禁食 12h，減少腸道菌群污染風險；取材操作需在超凈臺內(nèi)完成，全程無菌。
解剖分離大隱靜脈時，動作要輕柔，避免過度牽拉或擠壓血管組織，防止內(nèi)皮細胞脫落或損傷；分離后立即用預冷的 PBS（含雙抗）沖洗血管腔 3 次，去除殘留血液和雜質(zhì)。
血管組織離體后需在30min 內(nèi)進入消化流程，避免長時間暴露于室溫導致細胞活性下降。
二、分離消化環(huán)節(jié)注意事項
采用胰蛋白酶 - 膠原酶聯(lián)合消化法時，需嚴格控制酶濃度和消化時間：推薦使用 0.1% 胰蛋白酶 + 0.1% 膠原酶 I，37℃振蕩消化 15-20min，期間每隔 5min 鏡檢觀察組織消化狀態(tài)，避免過度消化導致細胞破裂。
消化終止需使用含 10% FBS 的完全培養(yǎng)基，中和酶活性；吹打組織塊時力度適中，避免產(chǎn)生過多氣泡損傷細胞。
差速貼壁法純化內(nèi)皮細胞時，首次貼壁時間控制在30min，利用成纖維細胞貼壁速度快于內(nèi)皮細胞的特點，棄去首次貼壁的上清液，將含內(nèi)皮細胞的上清液轉(zhuǎn)移至新的包被好的培養(yǎng)瓶中。
三、培養(yǎng)環(huán)節(jié)注意事項
培養(yǎng)瓶/皿需提前用0.1% 明膠或 0.1mg/ml PLL包被，37℃孵育 2h，棄去多余包被液，晾干后使用，提升內(nèi)皮細胞貼壁效率。
培養(yǎng)基選擇內(nèi)皮細胞專用培養(yǎng)基，添加 5%-10% 胎牛血清（優(yōu)選低內(nèi)毒素血清）、內(nèi)皮細胞生長因子（ECGS）、雙抗（青霉素 100U/ml + 鏈霉素 100μg/ml），避免使用普通 DMEM 培養(yǎng)基，防止細胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化。
培養(yǎng)環(huán)境嚴格控制為37℃、5% CO?、飽和濕度，CO?濃度波動不超過 ±0.5%，溫度偏差不超過 ±0.5℃；培養(yǎng)基更換頻率為首次培養(yǎng) 48h 后換液，之后每 2-3 天換液 1 次，換液時輕柔操作，避免沖刷細胞層。
避免頻繁觀察和挪動培養(yǎng)瓶，減少對細胞的機械刺激；鏡檢時嚴格無菌操作，避免長時間開蓋導致污染。
四、傳代環(huán)節(jié)注意事項
傳代時機為細胞融合度達到70%-80% 時，此時細胞活性最佳，超過 90% 融合易導致細胞接觸抑制，影響增殖能力。
傳代消化使用0.25% 胰蛋白酶 + 0.02% EDTA，消化時間控制在 2-3min，鏡下觀察到細胞變圓、間隙增大時立即終止消化；吹打細胞時沿瓶壁輕柔吹打，制成單細胞懸液，避免細胞成團。
原代內(nèi)皮細胞傳代次數(shù)不超過 3 代，超過 3 代后細胞易發(fā)生衰老和表型丟失；傳代比例控制在 1:2，避免稀釋度過大導致細胞難以貼壁。
傳代后 24h 內(nèi)禁止換液，保證細胞有足夠時間貼壁，24h 后觀察貼壁情況，及時更換新鮮培養(yǎng)基。
五、污染防控與質(zhì)量控制注意事項
全程嚴格無菌操作，實驗器械需高壓滅菌，試劑需用 0.22μm 濾膜過濾除菌；定期檢測培養(yǎng)基和血清的支原體污染，可采用 PCR 法或熒光染色法。
細胞純度鑒定需在培養(yǎng)后 48-72h 進行，采用CD31 或 vWF 免疫熒光染色，純度需≥90%；若成纖維細胞污染過多，可使用抗成纖維細胞篩選試劑盒去除雜細胞。
避免反復凍融原代細胞，若需保存，建議在第 1 代細胞融合度 70% 時凍存，凍存液配方為培養(yǎng)基：血清：DMSO=7:2:1，程序降溫后放入液氮保存。
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