人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中需要注意的事項(xiàng)！
小楊 / 2026-01-16 09:22:10
一、無菌操作相關(guān)（核心底線）
1、環(huán)境與耗材滅菌
超凈工作臺需每日用 75% 酒精擦拭臺面，操作前紫外照射 30min（注意避免紫外直接照射培養(yǎng)基、血清等試劑）；每周對工作臺進(jìn)行一次徹底消毒。
所有耗材（培養(yǎng)瓶、離心管、移液管等）需經(jīng)高壓蒸汽滅菌（121℃、15psi、20min）或一次性無菌耗材；移液器槍頭需提前滅菌，使用前在超凈臺內(nèi)開封。
2、試劑處理與操作規(guī)范
胎牛血清（FBS）需 56℃水浴滅活 30min（破壞補(bǔ)體，避免損傷細(xì)胞），滅活后分裝保存于 - 20℃，避免反復(fù)凍融；雙抗需按終濃度添加，不可過量（長期高濃度雙抗會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)激）。
操作時(shí)佩戴無菌手套，每 30min 更換一次；移液時(shí)避免移液器觸碰非無菌區(qū)域，不同試劑的移液管/槍頭分開使用，防止交叉污染。
若培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁、顏色異常、出現(xiàn)絮狀沉淀，需立即丟棄，排查是否為細(xì)菌/真菌/支原體污染；支原體污染無明顯肉眼特征，需定期用 PCR 法檢測，污染后建議丟棄細(xì)胞，徹底消毒培養(yǎng)箱。
二、細(xì)胞消化與傳代控制
1、胰酶消化的精準(zhǔn)把控
消化前需用無鈣鎂 PBS 潤洗 2 次（去除血清中鈣鎂離子，避免抑制胰酶活性）；胰酶濃度嚴(yán)格使用 0.25%（含 0.02% EDTA），T25 瓶加 1mL、T75 瓶加 2mL，確保均勻覆蓋細(xì)胞表面。
消化時(shí)間控制在 1-2min（37℃），需在倒置顯微鏡下實(shí)時(shí)觀察：細(xì)胞變圓、間隙增大時(shí)立即加入含血清的完全培養(yǎng)基中和（血清中胰酶抑制劑可終止消化），避免過度消化導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷、細(xì)胞死亡。
吹打細(xì)胞時(shí)動(dòng)作輕柔，使用 1mL 移液器緩慢吹打（避免產(chǎn)生氣泡），確保細(xì)胞完全脫落且形成單細(xì)胞懸液，減少細(xì)胞聚團(tuán)（聚團(tuán)會(huì)導(dǎo)致貼壁不均、生長緩慢）。
2、傳代比例與時(shí)機(jī)
傳代時(shí)機(jī)為細(xì)胞融合度達(dá) 80%-90%，此時(shí)細(xì)胞增殖活性最佳；若融合度過高（＞95%），易出現(xiàn)接觸抑制，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯、表型改變。
傳代比例建議 1:3~1:4，不可過?。ǎ?:5），否則細(xì)胞難以貼壁和增殖；也不可過密（＞1:2），易引發(fā)營養(yǎng)不足、代謝廢物堆積。
傳代后 24h 內(nèi)避免晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，確保細(xì)胞均勻貼壁；24h 后觀察貼壁情況，未貼壁的死細(xì)胞需通過換液去除。
三、培養(yǎng)基與培養(yǎng)環(huán)境優(yōu)化
1、培養(yǎng)基的配置與保存
基礎(chǔ)培養(yǎng)基優(yōu)先選擇 DMEM/F12（1:1），含 L - 谷氨酰胺（無需額外添加，避免分解失效）；完全培養(yǎng)基需現(xiàn)配現(xiàn)用，4℃保存不超過 1 周，避免谷氨酰胺分解、pH 值改變。
可選添加胰島素 - 轉(zhuǎn)鐵蛋白 - 硒（ITS）添加劑（終濃度 1×），可維持近曲小管上皮細(xì)胞的分化表型，減少傳代后的去分化；避免添加糖皮質(zhì)激素等可能改變細(xì)胞功能的試劑。
培養(yǎng)基 pH 需維持在 7.2-7.4（通過 HEPES 緩沖液調(diào)節(jié)，終濃度 10mM），pH 過高（＞7.6）或過低（＜7.0）都會(huì)抑制細(xì)胞增殖，培養(yǎng)箱內(nèi)需定期檢查 CO?濃度（5%）和濕度（＞95%）。
2、溫度與氣體環(huán)境
培養(yǎng)箱溫度嚴(yán)格控制在 37℃±0.5℃，溫度波動(dòng)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂；定期校準(zhǔn)培養(yǎng)箱溫度，避免開門次數(shù)過多導(dǎo)致溫度驟變。
培養(yǎng)瓶需松蓋培養(yǎng)（保證 CO?交換），但需在培養(yǎng)箱內(nèi)放置滅菌水盤維持濕度，防止培養(yǎng)基蒸發(fā)；若長期培養(yǎng)（＞72h），需檢查培養(yǎng)基體積，及時(shí)補(bǔ)加。
四、凍存與復(fù)蘇的關(guān)鍵細(xì)節(jié)
1、凍存操作
凍存液需現(xiàn)配（55% DMEM/F12 + 40% FBS + 5% DMSO），DMSO 需為細(xì)胞級，且在 4℃預(yù)冷；DMSO 有細(xì)胞毒性，需輕柔重懸細(xì)胞，避免劇烈震蕩。
細(xì)胞密度調(diào)整至 1×10?~5×10? cells/mL，分裝后需程序降溫：4℃ 30min→-20℃ 1h→-80℃過夜→液氮長期保存；不可直接將凍存管放入液氮（冰晶會(huì)刺破細(xì)胞膜）。
凍存管需標(biāo)記清晰（細(xì)胞名稱、代次、凍存日期），液氮罐中分區(qū)存放，避免混淆。
2、復(fù)蘇操作
復(fù)蘇時(shí)凍存管從液氮取出后，需立即投入 37℃水浴鍋快速搖晃（1-2min），確保凍存液完全融化（殘留冰晶會(huì)損傷細(xì)胞）；融化后盡快轉(zhuǎn)移至超凈臺，避免室溫放置過久。
復(fù)蘇后離心去除 DMSO（800rpm 5min），不可省略此步驟（DMSO 常溫下毒性增強(qiáng)）；重懸細(xì)胞時(shí)使用預(yù)熱的完全培養(yǎng)基，避免溫度驟變。
五、細(xì)胞表型與狀態(tài)監(jiān)測
1、日常觀察
每日在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)：正常 HK-2 細(xì)胞為上皮樣，呈鋪路石狀排列，胞質(zhì)透亮，無空泡；若出現(xiàn)細(xì)胞皺縮、空泡增多、邊緣模糊，提示細(xì)胞狀態(tài)變差，需及時(shí)換液或傳代。
記錄細(xì)胞倍增時(shí)間（正常 HK-2 細(xì)胞倍增時(shí)間約 24-48h），若倍增時(shí)間延長，需排查營養(yǎng)不足、污染或傳代次數(shù)過多。
2、傳代次數(shù)限制
該細(xì)胞系傳代超過 20 代后易出現(xiàn)表型漂移，建議使用低代次（＜15 代）細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；可提前凍存多管低代次細(xì)胞，避免反復(fù)傳代。
六、特殊試劑安全
DMSO 為易燃、有毒試劑，操作時(shí)需在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行，避免接觸皮膚和呼吸道；若不慎接觸，立即用大量清水沖洗。
廢棄的細(xì)胞懸液、培養(yǎng)基需經(jīng)高溫滅菌（121℃ 20min）后再丟棄，避免生物安全風(fēng)險(xiǎn)。
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