一、背景
SW780人膀胱移行癌貼壁細(xì)胞系是由A·Leibovitz在1974年從第一期移行細(xì)胞瘤中建立的細(xì)胞株，該患者接受過術(shù)前化療(Thiotepa)；報(bào)道稱該細(xì)胞的植板率為41%。
二、SW780人膀胱移行癌貼壁細(xì)胞系培養(yǎng)操作規(guī)程
1、SW780人膀胱移行癌貼壁細(xì)胞系培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：
準(zhǔn)備H-DMEM培養(yǎng)基，90%；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%。
SW780人膀胱移行癌貼壁細(xì)胞系培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
SW780人膀胱移行癌貼壁細(xì)胞系凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲(chǔ)存。
2、SW780人膀胱移行癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞處理：
1）復(fù)蘇SW780人膀胱移行癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）SW780人膀胱移行癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對(duì)于SW780人膀胱移行癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞，傳代可參考以下方法：
棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗SW780人膀胱移行癌貼壁細(xì)胞系1-2次。
加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化2-3分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3ml此細(xì)胞的培養(yǎng)基終止消化。
輕輕吹打后吸出，移入15ml離心管中，在1200RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)液后吹勻。
移入到事先準(zhǔn)備好的含有5ml培養(yǎng)基的T-25培養(yǎng)瓶中或含有14ml培養(yǎng)基的T-75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
3）SW780人膀胱移行癌貼壁細(xì)胞系凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。貼壁細(xì)胞凍存時(shí)，先要消化處理并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。消化方法按照細(xì)胞傳代方法的1-3步驟進(jìn)行，最后的重懸液使用血清。懸浮細(xì)胞直接計(jì)數(shù)后離心，用血清重懸浮，加DMSO至最終濃度為10%。加入DMSO后迅速混勻，按每1ml的數(shù)量分配到凍存管中。
三、應(yīng)用
SW780人膀胱移行癌貼壁細(xì)胞系可以用于蛇葡萄素（Amp）誘導(dǎo)人膀胱癌細(xì)胞株SW780凋亡的研究：
研究蛇葡萄素體外對(duì)人膀胱癌細(xì)胞株SW780增殖的抑制作用及凋亡機(jī)制的探索。
方法：①采用MTT比色法檢測(cè)Amp處理人膀胱癌細(xì)胞株SW780 48h、72h后對(duì)其增殖的抑制作用;
②熒光顯微鏡觀察不同濃度Amp作用人膀胱癌細(xì)胞株SW780后細(xì)胞的凋亡狀態(tài)的變化情況;
③采用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)不同濃度Amp對(duì)人膀胱癌細(xì)胞株SW780線粒體膜電位、細(xì)胞pH值及細(xì)胞內(nèi)Ca2+度的影響;
④Western Blot檢測(cè)不同濃度Amp作用于人膀胱癌細(xì)胞株SW780 48 h后p-Bcl-2、Bax與Cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)情況與Amp 150μgml處理人膀胱癌細(xì)胞SW780 12 h、24 h、48 h后p-Bcl-2、Bax與Cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)情況。
結(jié)果：①M(fèi)TT法體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:在Amp濃度分別為60μg/ml、72μg/ml、87μg/ml、104μg/ml、125μg/ml和150μg/ml時(shí)對(duì)人膀胱癌細(xì)胞株SW780增殖具有明顯的抑制作用,Amp作用于人膀胱癌細(xì)胞株SW780 48 h、72 h時(shí),IC50值分別為83.91±2.15μg/ml、66.52±3.60μg/ml。
②熒光顯微鏡觀察不同濃度Amp作用于人膀胱癌細(xì)胞株SW780的凋亡狀態(tài)顯示:Amp藥物處理組均可引起細(xì)胞不同程度的凋亡,與陰性對(duì)照組相比,藥物濃度越大,細(xì)胞凋亡特征越明顯,凋亡數(shù)量越多。
③激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)不同濃度Amp處理人膀胱癌細(xì)胞株SW780后線粒體膜電位變化顯示:Amp藥物處理組均可引起線粒體膜電位熒光強(qiáng)度降低,并且藥物濃度越大,線粒體膜電位熒光強(qiáng)度越低,呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性;測(cè)定不同濃度Amp作用于人膀胱癌細(xì)胞株SW780細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化顯示:Amp藥物處理組均可引起細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度增高,并且藥物濃度越大,細(xì)胞熒光強(qiáng)度越大,呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性;測(cè)定不同濃度組Amp作用于人膀胱癌細(xì)胞SW780線粒體內(nèi)pH值變化顯示:Amp藥物處理組與陰性對(duì)照組差別不大,均呈現(xiàn)較強(qiáng)熒光強(qiáng)度,無劑量依賴性。
④Western Blot檢測(cè)不同濃度Amp作用于SW780后Bcl-2蛋白的活化形式p-Bcl-2、Bax與Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)顯示:與陰性對(duì)照組比較,隨著藥物濃度的增大,Bcl-2蛋白的活化形式p-Bcl-2蛋白表達(dá)量降低,Bax蛋白表達(dá)量增高,Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量增高,呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。Western Blot檢測(cè)Amp(150μg/ml)處理細(xì)胞SW780 12 h、24 h、48 h后Bcl-2蛋白的活化形式p-Bcl-2、Bax與Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)顯示:與陰性對(duì)照組比較,隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng),Bcl-2蛋白的活化形式p-Bcl-2蛋白表達(dá)量降低,Bax蛋白表達(dá)量增高,Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量增高,呈現(xiàn)明顯的時(shí)間依賴性。
結(jié)論：1、Amp對(duì)人膀胱癌細(xì)胞株SW780增值具有明顯的抑制作用,并呈現(xiàn)時(shí)間和濃度依賴性。
2、Amp體外可以通過線粒體途徑誘導(dǎo)人膀胱癌細(xì)胞株SW780的凋亡。
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