一、背景
NCI-H292（人肺癌細(xì)胞(淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)）源自肺支氣管黏液上皮樣癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶；先用成份限定的培養(yǎng)基分離得到，然后換成含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)條件下，NCI-H292細(xì)胞保留了黏液上皮的特性，可從其超微結(jié)構(gòu)的表現(xiàn)和多種鱗狀上皮分化標(biāo)記的表達(dá)而判斷。NCI-H292細(xì)胞支持HBV的生長(zhǎng)，脫羧酶陰性。NCI-H292細(xì)胞可以作為篩選模型，將人類(lèi)亞基因組片段轉(zhuǎn)染入細(xì)胞來(lái)研究HBV及其自身基因在病毒性肝炎和肝癌發(fā)生中的作用。NCI-H292細(xì)胞角蛋白、波形蛋白、黏液洋紅染色陽(yáng)線，但神經(jīng)絲三聯(lián)蛋白陰性。
二、NCI-H292（人肺癌細(xì)胞(淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)）培養(yǎng)步驟
（一）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加4-6mL完全培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6cm皿中），培養(yǎng)過(guò)夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
（二）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
2. 加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的完全培養(yǎng)基終止消化。
3.輕輕吹打細(xì)胞，完全脫落后吸出，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4. 按5-6ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)液，將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新的含5-6 ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中。
b）傳代方法：
方法一：收集細(xì)胞，1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄上清液，補(bǔ)加1-2ml培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或瓶中。
方法二：可選擇半數(shù)換液方式，棄半數(shù)培養(yǎng)基后，將剩余細(xì)胞懸起，將細(xì)胞懸液按1:2到1:3的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基新皿中或者瓶中。
（三）細(xì)胞凍存：（注：無(wú)血清凍存液凍存細(xì)胞的方法請(qǐng)參考我司官網(wǎng)貨號(hào)：C7001）
1、細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時(shí)，棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞一次；
2、添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后加入完全培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打細(xì)胞使之脫落，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1000rpm離心5min；
3、用適量的凍存液重懸細(xì)胞，并放置于凍存管中；
4、先將細(xì)胞凍存管放置于-20℃ 1.5h，然后將其移入-80℃。
三、應(yīng)用
NCI-H292（人肺癌細(xì)胞(淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)）可以用于JNK信號(hào)通路在多聚左旋精氨酸誘導(dǎo)NCI-H292細(xì)胞凋亡中的作用及其機(jī)制研究：
探討c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)通路在多聚左旋精氨(Poly-L-arginine,PLA)誘導(dǎo)NCI-H292細(xì)胞凋亡中的作用及其分子機(jī)制。
方法：
1、細(xì)胞培養(yǎng):NCI-H292細(xì)胞生長(zhǎng)于10%胎牛血清+100 mg/L青霉素+100 mg/L鏈霉素+12mmol/L L-谷氨酰胺的RPMI1640培養(yǎng)液中,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),每2天換液1次。
2、Western Blot法檢測(cè)JNK信號(hào)通路蛋白的表達(dá)選擇PLA為凋亡誘導(dǎo)物,誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞NCI-H292的凋亡。分別以0 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L濃度的PLA刺激NCI-H292細(xì)胞24小時(shí)后提取各組細(xì)胞總蛋白,采用Western Blot法檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)P-JNK/JNK表達(dá)有無(wú)差異。
3、Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)NCI-H292細(xì)胞凋亡情況將NCI-H292細(xì)胞設(shè)為空白對(duì)照組、PLA組、SP600125組、PLA+SP600125組,按照分組要求提前1h用特異性JNK通路抑制劑SP600125預(yù)處理NCI-H292細(xì)胞,然后加入PLA,處理細(xì)胞24小時(shí)后收集各組細(xì)胞,采用Annexin V和PI雙染的方法,染色凋亡的NCI-H292細(xì)胞,并于4小時(shí)內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞的檢測(cè)分析,觀察JNK通路抑制劑SP600125(10μM)作用前后細(xì)胞的凋亡情況。
4、Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Casepase-3的表達(dá)采用Western Blot方法分別檢測(cè)空白對(duì)照組、PLA組、SP600125組、PLA+SP600125組中NCI-H292細(xì)胞內(nèi)Bax、Bcl-2、Casepase-3的表達(dá)和信號(hào)通路蛋白JNK、P-JNK的表達(dá)。
5、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA);兩兩間比較當(dāng)方差齊時(shí)采用LSD-t檢驗(yàn),方差不齊時(shí)采用Dunnett′s T3檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)果：
1、PLA濃度10 mg/L組作用NCI-H292細(xì)胞后JNK磷酸化水平與0mg/L組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.179),PLA作用濃度為20 mg/L組、40 mg/L組、60 mg/L組的JNK磷酸化水平與0mg/L組比較均增加,且呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.239,P均<0.05)。
2、空白對(duì)照組、PLA組、SP600125組、PLA+SP600125組NCI-H292細(xì)胞凋亡率分別為(5.13±1.12)%、(22.62±1.66)%、(5.69±0.18)%、(8.99±1.74)%,各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=113.961,P<0.001);PLA組NCI-H292細(xì)胞凋亡率與空白對(duì)照組相比明顯增高(P<0.001);PLA+SP600125組與PLA組比較細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.001)。
3、PLA(40 mg/L)作用于NCI-H292細(xì)胞后,P-JNK/JNK比值與空白對(duì)照組相比明顯升高(F=31.778,P<0.001);凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2/Bax比值降低(F=21.077,P<0.01);Caspase-3表達(dá)明顯升高(F=31.768,P<0.001)。
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