一、背景
人正常前列腺基質永生化細胞來源于同一張成人前列腺組織切片的周圍區(qū)域的基質細胞。通過一個pRSTV質料結構，用SV40大T抗原對基質細胞進行永生化。WPMY-1細胞，與RWPE-1細胞及其它上皮細胞衍生株一樣，屬于來源于同一個前列腺的一系列細胞株。由于它們來源于同一個前列腺的周圍區(qū)域，WPMY-1細胞株對于研究分泌和基質與上皮細胞相互作用尤其有用。據(jù)提供者報道，來源于同一個前列腺的RWPE-1細胞株(ATCC CRL-11609)，經過檢測，乙肝、丙肝、人免疫缺陷病毒都呈陰性。
二、人正常前列腺基質永生化細胞培養(yǎng)操作
1）復蘇人正常前列腺基質永生化細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或將細胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。
2）人正常前列腺基質永生化細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)；
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3.按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.將人正常前列腺基質永生化細胞懸液按1：2比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）人正常前列腺基質永生化細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。
下面T25瓶為類；
1.細胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，細胞變圓脫落后，加入1ml含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計數(shù)板計數(shù)。
2.4 min 1000rpm離心去掉上清。加1ml血清重懸細胞，根據(jù)細胞數(shù)量加入血清和DMSO，輕輕混勻，DMSO終濃度為10%，細胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存1ml細胞懸液，注意凍存管做好標識。
3.將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，2個小時以后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應用
人正常前列腺基質永生化細胞可以用于LncRNA/BLM對前列腺癌細胞增殖的影響研究：
以不同株系前列腺癌細胞(LNCaP、22RV-1)和正常前列腺基質成纖維細胞(WPMY-1)為研究對象,通過qRT-PCR、分子克隆、細胞培養(yǎng)、細胞轉染、細胞增殖、劃痕實驗、Western blot等技術,篩選和鑒定與BLM基因相關的LncRNA BLNC203和BLNC246基因,檢測在mRNA水平BLM、BLNC203、BLNC246的表達水平,在蛋白水平檢測相關基因BLM的表達差異。
解析在LncRNA的調控下前列腺癌細胞的增殖效應的研究,為進一步研究以BLM解旋酶基因為抗癌靶標藥物及早期診斷治療提供基礎科學依據(jù),主要研究結果如下：
1、人BLM基因相關LncRNAs的篩選及其在不同細胞中的表達分析通過在線網站NCBI、miRBase、NONCODE(http://www.noncode.org/)及對BLM相關LncRNAs進行篩選鑒定。
結果篩選出與BLM相關的LncRNAs(NONHSAT203515.1 BLNC203)(NONHSAT246735.1 BLNC246),BLNC203長為862 bp,位于5號染色體上;BLNC246長為375 bp位于3號染色體上。兩者含有二級結構和開放閱讀框。在不同細胞中qRT-PCR結果顯示;以正常人的前列腺基質成纖維細胞(WPMY-1)為對照組,BLM在LNCaP、22RV-1細胞中都低于正常細胞,在LNCaP細胞中是極顯著低于正常細胞(P<0.01);在22RV-1細胞中是顯著低于正常細胞(P<0.05),BLNC203在22RV-1細胞中的表達量都極顯著高于正常細胞(P<0.01),在LNCaP細胞中不顯著(P>0.05)。BLNC246在LNCaP細胞中表達量都極顯著低于正常細胞(P<0.01),在22RV-1細胞中不顯著(P>0.05)。推測兩基因可能在不同細胞中存在不同的表達現(xiàn)象。
2、超表達BLNC203、BLNC246對相關基因BLM的影響構建真核表達載體pcDNA3.1(+)-BLNC203和pcDNA3.1(+)-BLNC246轉染至不同株系前列腺癌細胞和正常前列腺細胞中,利用qRT-PCR和Western blot技術檢測相關基因BLM的表達水平。
結果顯示，在mRNA水平,正常細胞WPMY-1中空載體對照組與試驗組中BLNC203、BLNC246基因的表達上調;BLM基因在空載體對照組與試驗組中的表達下調。在前列腺癌細胞LNCaP中空白對照組與試驗組中BLNC203、BLNC246基因表達上調,BLM基因在空載體對照組與試驗組中的表達仍然上調;在前列腺癌細胞22RV-1中空白對照組與試驗組中BLNC203、BLNC246基因的表達上調,BLM基因在空載體對照組與試驗組中的表達量是上調。在蛋白水平上,在前列腺癌細胞22RV-1中當超表達BLNC203、BLNC246后,BLM基因的表達量與空載體pcDNA相比表達量上調;在前列腺癌細胞LNCaP細胞中當超表達BLNC203、BLNC246后,BLM基因的表達量與空載體pcDNA相比表達量上調;在正常前列腺基質成纖維細胞WPMY-1中,當超表達BLNC203、BLNC246后,BLM基因的表達量下調。在超表達BLNC203和BLNC246后在mRNA水平和蛋白水平BLM基因在正常細胞中的表達下調,在前列腺癌細胞中則是上調。在mRNA水平與蛋白水平表達模式則保持一致。
3、超表達BLNC203和BLNC246對細胞增殖能力和遷移的影響構建成功的超表達載體pcDNA3.1(+)-BLNC203和pcDNA3.1(+)-BLNC246轉染至不同株系前列腺癌細胞和正常前列腺細胞中,采用劃痕實驗檢測細胞的遷移能力,CCK8檢測細胞的增殖能力。
結果顯示，在劃痕實驗中前列腺癌細胞LNCaP和22RV-1在48 h的遷移效果最強,CCK8實驗檢測細胞的增殖效應顯示當超表達BLNC203和BLNC246后與pcDNA空載體相比則是促進了細胞的增殖。
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