一、背景
人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞提取于人肝臟組織，于原代末期凍存。此細(xì)胞通過(guò)Cytokeratin-18,-19 and Vimentin免疫熒光染色驗(yàn)證，經(jīng)測(cè)試不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌。細(xì)胞可以達(dá)到15倍增。
內(nèi)膽管上皮細(xì)胞排列成肝內(nèi)膽管樹(shù)，在肝臟中形成不同直徑的三維管道網(wǎng)。它們僅由3-5%的肝臟細(xì)胞組成，但每天產(chǎn)生的膽汁能多達(dá)總量的40%。大量研究表明，肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞通過(guò)控制激素調(diào)控的分泌和吸收，在保持、調(diào)整和擴(kuò)大膽小管的結(jié)構(gòu)中發(fā)揮重要作用。肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞在先天性和獲得性免疫應(yīng)答方面起著積極作用。比如：肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞分泌趨化因子和細(xì)胞因子，通過(guò)表達(dá)重要的細(xì)胞粘附分子使免疫反應(yīng)局部化。一般情況下，肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞通過(guò)有絲分裂增值。然而，在某些條件下，肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞會(huì)明顯增生。
二、人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞接收后，請(qǐng)按照以下方法進(jìn)行操作：
1、取出25cm2培養(yǎng)瓶，75%酒精擦拭培養(yǎng)瓶，拆下封口膜，放入37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置3-4小時(shí)以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)，然后換用新鮮人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)或進(jìn)行傳代。
2、人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞傳代：
1）細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時(shí)，棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞一次；
2）添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后加入人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，再輕輕吹打細(xì)胞使之脫落，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1000rpm離心5min；
3）棄上清，沉淀細(xì)胞用12ml人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞培養(yǎng)基重懸，然后按1:2比例進(jìn)行分瓶傳代，后放入37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
4）待人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞貼壁后，觀察培養(yǎng)結(jié)果，之后進(jìn)行換液培養(yǎng)或傳代。
3、細(xì)胞凍存：
1）細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時(shí)，棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞一次；
2）添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后加入人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打細(xì)胞使之脫落，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1000rpm離心5min；
3）用適量的凍存液（FBS：DMSO=9：1）重懸細(xì)胞，并放置于凍存管中；
4）先將細(xì)胞凍存管放置于-20℃1.5h，然后將其移入-80℃過(guò)夜，24h后轉(zhuǎn)入液氮中進(jìn)行長(zhǎng)期保存。使用程序降溫盒可直接放入-80℃。
4、人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞復(fù)蘇：
1）從液氮中取出細(xì)胞凍存管，快速將其置入37℃水浴中解凍，直至凍存管中無(wú)結(jié)晶，然后用75%的酒精擦拭凍存管外壁；
2）將凍存管中的細(xì)胞移至含5ml人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞培養(yǎng)基的15ml離心管中，1000rpm離心5min；
3）棄上清，沉淀用5ml人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞培養(yǎng)基重懸，接種25cm2培養(yǎng)瓶，于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
4）第二天，換用新鮮人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
三、應(yīng)用
人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞可以用于LPS通過(guò)激活TLR4誘導(dǎo)人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化：
研究Toll樣受體4(TLR4)在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞(HIB ECs)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)中的作用及核轉(zhuǎn)錄因子Snail是否與參與該過(guò)程的調(diào)控。
方法：體外培養(yǎng)人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞,CON+LPS組加終濃度為2ug/ml的LPS誘導(dǎo)72h,CON組不作處理作為對(duì)照。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化;Real-time PC R檢測(cè)上皮標(biāo)記物E-cadherin,間質(zhì)標(biāo)記物N-cadherin、Vimentin,TLR4、核轉(zhuǎn)錄因子Snailm RNA表達(dá)量;Western blot檢測(cè)以上各指標(biāo)蛋白表達(dá)量;Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)評(píng)估各組細(xì)胞移動(dòng)能力。KD+LPS組構(gòu)建TLR4 si RNA慢病毒載體,采用RN A干擾技術(shù)沉默HIBECs中TLR4,NC+LPS組空白病毒轉(zhuǎn)染作為對(duì)照,轉(zhuǎn)染72h后分別予終濃度為2ug/ml的LPS誘導(dǎo),72h后通過(guò)上述方法觀察慢病毒轉(zhuǎn)染對(duì)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)改變,TLR4、Snail、上皮間質(zhì)標(biāo)記物基因表達(dá)改變的影響。
結(jié)果：
1、LPS誘導(dǎo)HIBECs 72h,CON+LPS組細(xì)胞由上皮向間葉樣細(xì)胞形態(tài)改變;與CON組相比,CON+LPS組上皮標(biāo)記物E-cadherin m RNA表達(dá)下調(diào)(P<0.05),間質(zhì)標(biāo)記物N-cadherin、Vimentin m RNA表達(dá)上調(diào)(P<0.05,P<0.05);上述指標(biāo)蛋白水平表達(dá)趨勢(shì)與m RNA一致;兩組細(xì)胞轉(zhuǎn)移率無(wú)差異(P>0.05);提示:LPS可誘導(dǎo)HIB ECS發(fā)生EMT。
2、CON+LPS組TLR4 m RNA表達(dá)量高于CON組(P<0.05);蛋白水平表達(dá)前者較高;提示:LPS可導(dǎo)致HIBECs中TLR4表達(dá)增加。
3、CON+LPS組Snail m RNA表達(dá)量高于CON組(P<0.05);蛋白水平表達(dá)前者較高;提示:LPS可導(dǎo)致HIBECs中Snail表達(dá)增加。
4、KD+LPS組TLR4 Si RNA慢病毒轉(zhuǎn)染HIBECs,TLR4 m RNA表達(dá)量較NC+L PS組降低(P<0.05);蛋白水平表達(dá)量前者較低。提示:TLR4Si RNA慢病毒轉(zhuǎn)染能減弱LPS誘導(dǎo)HIBECs中TLR4基因表達(dá)上調(diào)。
5、沉默HIBECs中TLR4,KD+LPS組Snail m RNA表達(dá)量較NC+LPS組降低(P<0.05)。蛋白水平表達(dá)前者較低。提示:沉默TLR4能減弱LPS誘導(dǎo)HIBECs中Sn ail基因表達(dá)上調(diào)。
6、沉默HIBECs中TLR4,KD+LPS組細(xì)胞由上皮向間葉樣細(xì)胞形態(tài)改變不明顯。與NC+LPS組比較,KD+LPS組上皮標(biāo)記物E-cadherin m RNA表達(dá)較高(P<0.05),間質(zhì)標(biāo)記物N-cadherin、Vimentin m RNA表達(dá)較低(P<0.05,P<0.05)。兩組上述指標(biāo)蛋白水平表達(dá)趨勢(shì)與m RNA表達(dá)一致。提示:沉默TLR4能阻斷LPS誘導(dǎo)HIBEC s發(fā)生EMT。
結(jié)論：
1、LPS通過(guò)激活TLR4誘導(dǎo)HIBEC發(fā)生EMT;
2、LPS誘導(dǎo)HIBECs發(fā)生EMT可能受轉(zhuǎn)錄因子Snail調(diào)控。
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