一、背景
人T淋巴瘤細(xì)胞系是一株T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系。HuT 102細(xì)胞具有成熟T細(xì)胞系的特征，細(xì)胞表面呈現(xiàn)IL-2活性、E花環(huán)陽(yáng)性，表面免疫球蛋白、EBV核抗原和TdT反應(yīng)陰性。HuT 102細(xì)胞還可釋放與T細(xì)胞淋巴瘤相關(guān)的單一C型逆轉(zhuǎn)病毒，即HTLVI病毒。
二、人T淋巴瘤細(xì)胞系復(fù)蘇
1、將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時(shí)間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。
2、在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。
三、人T淋巴瘤細(xì)胞系傳代培養(yǎng)
1、吸取并棄掉培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基。
2、加入1.0 mL 0.25（w/v）Trypsin-0.53mM EDTA溶液，并置于37℃培養(yǎng)箱中孵育，直至細(xì)胞從壁上脫落分離。此過(guò)程大約需要3至5分鐘（此處為12.5 cm2培養(yǎng)瓶所用體積，可根據(jù)實(shí)際情況增減用量）。
3、加入2mL完全培養(yǎng)基中和胰蛋白酶，并輕輕吹打?qū)⒓?xì)胞從培養(yǎng)瓶表面吹落，并使細(xì)胞分散。
4、離心200x g/5 min，去除上清后，取適量的培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸,取適量懸液置于新的培養(yǎng)瓶中，并加入新鮮細(xì)胞完全培養(yǎng)基至總體積為4mL。
5、將細(xì)胞置于含有5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
四、凍存細(xì)胞操作步驟
1、將凍存管置于37℃水浴中來(lái)回晃動(dòng)，迅速解凍。為避免污染，確保凍存管口置于水面之上。解凍需迅速，大約2分鐘。
2、一旦凍存管中液體融化后，立即取出，采用70%酒精噴拭凍存管表面。從此步開(kāi)始，后續(xù)操作須在生物安全柜中完成。
3、將凍存管中的液體轉(zhuǎn)移到含有5mL完全培養(yǎng)基的離心管中，離心200×g/5-10 min，用真空泵去除含有凍存液的上清。
4、用完全培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)瓶中。為保證細(xì)胞復(fù)蘇的存活率，請(qǐng)將培養(yǎng)基在37℃水浴預(yù)熱后使用。
5、將細(xì)胞置于含有5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
五、應(yīng)用
人T淋巴瘤細(xì)胞系可以用于雷公藤內(nèi)酯醇通過(guò)P38MAPK信號(hào)通路誘導(dǎo)皮膚T細(xì)胞淋巴瘤Hut102細(xì)胞的凋亡：
觀察雷公藤內(nèi)酯醇(Triptolide,TP)對(duì)皮膚T細(xì)胞淋巴瘤Hut102細(xì)胞株的增殖和凋亡率的影響,進(jìn)一步觀察雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)Hut102細(xì)胞株的凋亡誘導(dǎo)作用是否涉及到P38絲裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)信號(hào)通路和這條信號(hào)通路上的關(guān)鍵蛋白。
方法：采用MTT法檢測(cè)不同濃度的雷公藤內(nèi)酯醇干預(yù)后的Hut102細(xì)胞的增殖抑制率。利用Annexin v-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度的雷公藤內(nèi)酯醇以及取其中一個(gè)濃度組預(yù)先加入P38MAPK抑制劑SB203580處理后Hut102細(xì)胞的凋亡率。利用Western印跡法檢測(cè)不同濃度雷公藤內(nèi)酯醇以及取其中一個(gè)濃度組預(yù)先加入P38MAPK抑制劑SB203580處理后的Hut102細(xì)胞中磷酸化P38絲裂原活化蛋白激酶(P-P38MAPK)、caspase-3蛋白激酶、熱休克蛋白27(HSP27)的表達(dá)量。
結(jié)果：雷公藤內(nèi)酯醇可抑制Hut102細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)Hut102細(xì)胞的凋亡,并呈時(shí)間和劑量依賴方式(與對(duì)照組比較,P<0.05)。雷公藤可增加磷酸化P38MAPK、caspase-3(17KD)蛋白激酶的表達(dá),同時(shí)抑制HSP27蛋白的表達(dá),取其中一濃度組用P38MAPK特異性抑制劑SB203580預(yù)處理后,雷公藤內(nèi)酯醇誘導(dǎo)Hut102細(xì)胞的凋亡率明顯下降,磷酸化P38MAPK、caspase-3(17KD)蛋白激酶的表達(dá)降低,HSP27蛋白的被抑制效應(yīng)減弱(與對(duì)照組比較,P<0.05)。
結(jié)論：雷公藤內(nèi)酯醇可誘導(dǎo)Hut102細(xì)胞凋亡,該作用可被P38MAPK特異性抑制劑SB203580部分抑制,提示雷公藤內(nèi)酯醇可能通過(guò)激活P38MAPK信號(hào)通路使部分Hut102細(xì)胞產(chǎn)生凋亡,雷公藤內(nèi)酯醇可以抑制Hut102細(xì)胞中高表達(dá)的小分子熱休克蛋白27,HSP27可能是P38MAPK信號(hào)通路上的一個(gè)重要蛋白。
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