一、背景
WISTAR大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基特別添加了能有效改善細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和特別甄選的優(yōu)質(zhì)胎牛血清，適合Wistar大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)。
培養(yǎng)基分裝成小瓶(100～200 mL)以便使用，翻帽塞塞緊瓶口。按細(xì)胞生長(zhǎng)需求，制備相應(yīng)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。一般的細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基為培養(yǎng)基+10%胎牛血清，最后按1％體積分?jǐn)?shù)加入雙抗貯存液(青霉素+鏈霉素)，使青霉素和鏈霉素的終濃度分別為100 U／mL和100 U／mL。
骨髓原始間充質(zhì)干細(xì)胞是骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，是人們?cè)诓溉閯?dòng)物的骨髓基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的一種具有分化形成骨、軟骨、脂肪、神經(jīng)及成肌細(xì)胞的多種分化潛能的細(xì)胞亞群。它們對(duì)骨髓中的造血干細(xì)胞（HSC）不僅有機(jī)械支持作用，還能分泌多種生長(zhǎng)因子（如IL-6，IL-11，LIF，M-CSF及SCF等）來(lái)支持造血。
骨髓間充質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)過(guò)程中，約24小時(shí)即可出現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞呈圓形、梭形、三角形生長(zhǎng)緩慢。換液后細(xì)胞增殖明顯，出現(xiàn)以梭形為主的多種形態(tài)，10-14天70%-80%可融合達(dá)到傳代標(biāo)準(zhǔn)。傳代細(xì)胞形態(tài)單一，呈梭形或扁平型，增殖至細(xì)胞融合時(shí)呈漩渦狀和放射狀排列。
二、應(yīng)用
用于異補(bǔ)骨脂素對(duì)小鼠骨髓脂代謝影響及其機(jī)制的相關(guān)研究：
研究發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松的骨質(zhì)中骨量的降低和骨髓腔中脂肪組織的增加具有相關(guān)性。經(jīng)典理論認(rèn)為成骨細(xì)胞和骨髓間質(zhì)中的脂肪細(xì)胞來(lái)源于同一種前體細(xì)胞,即骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。通過(guò)對(duì)去卵巢的骨質(zhì)疏松模型小鼠補(bǔ)充異補(bǔ)骨脂素來(lái)探討異補(bǔ)骨脂素在體內(nèi)對(duì)骨髓腔中脂肪細(xì)胞分化成熟能力的影響。
此外,通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)異補(bǔ)骨脂素在成骨誘導(dǎo)和成脂誘導(dǎo)條件下對(duì)C57/BL6小鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分別向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞成熟分化的能力的影響,并且明確了在以上兩種過(guò)程中細(xì)胞學(xué)或者是分子生物學(xué)的機(jī)制。以上的發(fā)現(xiàn)可能對(duì)臨床上治療骨代謝紊亂提供一條新的思路。
細(xì)胞培養(yǎng)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）分離至4周大的C57/BL6雌鼠,提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）。小鼠用CO2處死,股骨和脛骨被分離,骨髓腔用眼科剪剪開(kāi)后用1ML注射器吸取a-MEM（a-MEM;Gibco-BRL,GrandIsland,NY）培養(yǎng)基沖洗骨髓,沖洗至骨頭發(fā)白即可。
分離出的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）用10%的胎牛血清培養(yǎng),并在完全培養(yǎng)基中加入青／鏈霉素雙抗（100U/ml of penicillin-streptomycin;Invitrogen,Carlsbad,CA）,細(xì)胞培養(yǎng)基3天更換1次。
骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）種于96孔板和6孔板上進(jìn)行試驗(yàn),種植細(xì)胞的密度分別為1×104和1×106cells/well。細(xì)胞置于5%的C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃C恒溫培養(yǎng)。
成熟成骨細(xì)胞誘導(dǎo)方案為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）在6孔的細(xì)胞培養(yǎng)板中生長(zhǎng)約90%融合時(shí)加入成骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基（a-MEM細(xì)胞培養(yǎng)基含量為85%,胎牛血清含量為15%,青/鏈霉素雙抗比例為1%,100μmol/L的地塞米松,50μg/ml的維生素C磷酸酯,10mM的β-甘油磷酸鈉）,成骨培養(yǎng)基每3天更換1次。
成熟脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)方案為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）在培養(yǎng)皿中長(zhǎng)滿并種于6孔板中。培養(yǎng)至細(xì)胞約90%融合以后,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）用成熟脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)液開(kāi)始誘導(dǎo)。
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