一、背景
MKN7人胃癌貼壁細(xì)胞系來源于一位39歲女性胃癌上皮細(xì)胞樣細(xì)胞，KN7人胃癌貼壁細(xì)胞系培養(yǎng)基: RPMI1640培養(yǎng)基，90%；FBS，10%。
KN7人胃癌貼壁細(xì)胞系生長(zhǎng)條件:氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%;溫度：37℃。
二、MKN7人胃癌貼壁細(xì)胞系培養(yǎng)操作
1）復(fù)蘇MKN7人胃癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）MKN7人胃癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.將細(xì)胞懸液按1：2比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）MKN7人胃癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
下面T25瓶為類；
1.MKN7人胃癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入1ml含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
2.4 min 1000rpm離心去掉上清。加1ml血清重懸細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入血清和DMSO，輕輕混勻，DMSO終濃度為10%，細(xì)胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存1ml細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。
3.將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，2個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應(yīng)用
MKN7人胃癌貼壁細(xì)胞系可以用于PNO1通過自噬效應(yīng)促進(jìn)胃癌增殖的機(jī)制研究：
自噬作為一種程序性死亡機(jī)制在腫瘤中的作用越來越受到研究者們的關(guān)注,靶向自噬已經(jīng)成為腫瘤治療的一種重要手段。之前的研究表明核糖體裝配因子PNO1可以調(diào)節(jié)腫瘤的增殖、侵襲、自噬和凋亡等表型,但目前在胃癌中的作用還沒有被報(bào)道。本研究旨在揭示PNO1在胃癌中的作用及調(diào)節(jié)機(jī)制,為胃癌治療提供新的靶標(biāo)。
方法：利用生物數(shù)據(jù)庫(kù)中的信息檢測(cè)PNO1在胃癌和癌旁組織中的表達(dá),并收集青島大學(xué)附屬醫(yī)院經(jīng)病理確診的胃癌和癌旁手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行免疫組化分析驗(yàn)證,使用小干擾RNA、慢病毒顆粒構(gòu)建PNO1敲低和過表達(dá)的胃癌細(xì)胞株,使用蛋白免疫印跡和實(shí)時(shí)定量PCR來驗(yàn)證PNO1在胃癌細(xì)胞的表達(dá)及轉(zhuǎn)染效率,通過平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和Ed U細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PNO1對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響,使用蛋白免疫印跡和免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PNO1對(duì)自噬的調(diào)節(jié),通過蛋白免疫印跡分析PNO1對(duì)PI3K/AKT/mtor信號(hào)通路的調(diào)控作用,最后通過小鼠胃原位荷瘤模型驗(yàn)證PNO1在體內(nèi)對(duì)胃癌增殖的作用。
結(jié)果：在本研究中,發(fā)現(xiàn)PNO1在胃癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)并且相對(duì)高表達(dá)的PNO1水平與胃癌患者的不良預(yù)后相關(guān),過表達(dá)PNO1提高了胃癌細(xì)胞的增殖水平,敲低PNO1抑制了體內(nèi)外胃癌的增殖能力,并提高了胃癌細(xì)胞的自噬水平,抑制自噬逆轉(zhuǎn)了PNO1敲低導(dǎo)致胃癌細(xì)胞增殖能力下降的趨勢(shì),此外,敲低PNO1還抑制了PI3K/AKT/mtor信號(hào)通路的激活。
結(jié)論：研究表明PNO1高表達(dá)是胃癌患者的不良預(yù)后因素,PNO1通過抑制自噬效應(yīng)促進(jìn)了胃癌的增殖能力,這為探索胃癌發(fā)病機(jī)制提供了新的思路,靶向PNO1/自噬軸成為胃癌治療的潛在方案。
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