一、菌種簡(jiǎn)介
氧化硫硫桿菌(Thiobacillus thiooxidans,T.t)于1922年由Waksman和Joffe分離得到，具有快速氧化單質(zhì)硫以及還原態(tài)的硫化物的功能。專性好氧,嗜酸,革蘭氏陰性菌,棒狀,大小為1×2mm,寬0.3~0.5μm，長(zhǎng)1.0~2.0μm。氧化硫桿菌以氧化單質(zhì)硫或還原態(tài)的硫化物來獲得自身細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝所需要的能量,以NH4+為氮源,以空氣中CO2為碳源。
二、產(chǎn)品信息
平臺(tái)編號(hào)：Bio-134513
規(guī)格：凍干物
拉丁屬名：Thiobacillus Thiooxidans
中文名稱：硫氧化硫桿菌
拉丁名稱：Thiobacillus thiooxidans
模式菌株：否
來源歷史：←
收藏時(shí)間：2021/8/4
原始編號(hào)：BJMCC1.101
參考用途：生物浸礦。
生物危害程度：四類
致病對(duì)象：無
培養(yǎng)基名稱：Sulfobacillus Medium
培養(yǎng)基成分：溶液A：(NH4)2SO4 3g，KCl 0.1g，K2HPO4 0.5g，MgSO4.7H2O 0.5g，Ca(NO3)2 0.01g，蒸餾水700mL，用硫酸調(diào)節(jié)pH2.0-2.2。高壓蒸汽滅菌。 溶液B： FeSO4?7H2O 44.2g，蒸餾水300mL，10N H2SO4 1mL。過濾除菌。 溶液C：酵母浸粉（1% w/v水溶液） 20mL，高壓蒸汽滅菌。 上述分別滅菌后三個(gè)溶液混合即可，pH1.9-2.4。 [注] 若需要配制固體平板，瓊脂粉溶液（終濃度15g/L）需要單獨(dú)高壓蒸汽滅菌后，與上述成分冷至55℃時(shí)，混合傾注平板。
培養(yǎng)溫度：30 ℃
需氧類型：好氧
注意事項(xiàng)：僅用于科學(xué)研究或者工業(yè)應(yīng)用等非醫(yī)療目的不可用于人類或動(dòng)物的臨床診斷或治療，非藥用，非食用（產(chǎn)品信息以出庫為準(zhǔn)）
三、材料和方法
1、水樣采集
水樣取自某礦礦坑。取樣方法如下:先將用牛皮紙?jiān)玫娜悠颗c取樣勺用高壓滅菌器高壓滅菌,在取樣點(diǎn)打開牛皮紙,用酒精燈燒灼瓶口,舀取水樣至取樣瓶三分之二處,迅速扎好牛皮紙帶回。
2、培養(yǎng)基的配制
液體培養(yǎng)基采用Starky - Na2 S2O3 培養(yǎng)基和Waksman 培養(yǎng)基。 固體培養(yǎng)基采用Starky -Na2 S2O3 - 瓊脂培養(yǎng)基。
3、水樣處理
考慮到水樣的pH值在2. 5 左右,適合氧化硫硫桿菌的生長(zhǎng),細(xì)菌數(shù)目較多,所以將水樣倍比稀釋1 000倍。
4、細(xì)菌分離
取稀釋后的水樣10 mL加入到90 mL Starky- Na2 S2O3 培養(yǎng)基中,置恒溫水浴搖床培養(yǎng),溫度設(shè)定為30℃,轉(zhuǎn)速設(shè)定為200 r /min。待菌液pH值達(dá)到1. 0左右時(shí),取5 mL菌液加入到95 mL新的培養(yǎng)基中。如此反復(fù)進(jìn)行5次。
5、細(xì)菌純化
在事先用紫外線滅菌的潔凈操作工作臺(tái)中,取10μL培養(yǎng)好的菌液加入到固體培養(yǎng)基上,再用滅菌的涂菌器將菌液涂布均勻。將培養(yǎng)皿正置室溫2 h后轉(zhuǎn)到30℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。
6、單克隆挑選與培養(yǎng)
用滅菌的10 μL tip 頭從培養(yǎng)皿表面挑取形態(tài)規(guī)則,大小適中的單個(gè)菌落轉(zhuǎn)到液體培養(yǎng)基中,置30℃水浴搖床中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)速設(shè)置為200 r /min。待菌液pH值達(dá)到1. 0左右時(shí),取5 mL菌液加入到95 mL 新的培養(yǎng)基中(同時(shí)接種到Starky -Na2 S2O3 培養(yǎng)基和Waksman培養(yǎng)基中)。如此反復(fù)進(jìn)行5次。最后一次培養(yǎng)時(shí),每天測(cè)定pH值,當(dāng)pH值達(dá)到1. 0左右時(shí)用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)菌量。
四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1、細(xì)菌分離
培養(yǎng)時(shí)每天測(cè)定pH值,到第7天時(shí)pH值達(dá)到了1. 0. 染色后鏡檢發(fā)現(xiàn)視野下有較多行動(dòng)活躍的桿菌。
2、細(xì)菌純化
培養(yǎng)進(jìn)行到第12天可以看到培養(yǎng)皿上有針尖大小的菌落,到第20天可以看到菌落直徑長(zhǎng)至1 mm左右,呈綠色。
3、克隆挑選
挑選單克隆轉(zhuǎn)到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),每天測(cè)pH值,其中pH值變化最快的一株菌株變化情況使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),氧化硫硫桿菌的數(shù)量都達(dá)到了每毫升107 個(gè)。
五、總結(jié)
關(guān)于能在礦坑水和礦體土壤中生存的細(xì)菌已有不少的報(bào)道。目前用人工合成培養(yǎng)基已經(jīng)分離培養(yǎng)了許多新菌種,這些新菌種被推廣和應(yīng)用到生產(chǎn)過程中,產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
用于礦物浸出的微生物多為化能自養(yǎng)菌,在繁殖和生長(zhǎng)過程中,不要求任何有機(jī)物,純粹靠無機(jī)物為能量來源。 對(duì)于某些細(xì)菌,比如氧化亞鐵硫桿菌,一些有機(jī)物的存在還會(huì)抑制其生長(zhǎng)。 這些浸礦細(xì)菌有著一些共同的特點(diǎn):它們能在普通微生物所不能生存的強(qiáng)酸性礦坑水中生存,革蘭氏染色為陰性,活動(dòng)能力較強(qiáng),通過直接作用和間接作用浸出礦石。
氧化硫硫桿菌作為浸礦細(xì)菌的一種,生長(zhǎng)過程中也不需要有機(jī)物,它能通過對(duì)硫及其化合物的氧化獲得生長(zhǎng)和繁殖必須的能量。同時(shí),在這個(gè)過程中會(huì)產(chǎn)生硫酸和能溶于酸性介質(zhì)的金屬元素,達(dá)到加快浸礦速度,減少酸耗,從而降低生產(chǎn)成本的作用。并且,它在對(duì)貧礦和尾礦的處理上有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。 所以,選育生長(zhǎng)能力強(qiáng),氧化性能好的氧化硫硫桿菌具有重要的意義。
本研究中我們使用了Starky - Na2 S2O3 培養(yǎng)基和Waksman培養(yǎng)基,研究發(fā)現(xiàn),氧化硫硫桿菌在使用Na2 S2O3 做能源時(shí), pH值呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),我們認(rèn)為這是因?yàn)樵谘趸蛄驐U菌生長(zhǎng)的初期,它在溶液中發(fā)生緩慢的歧化反應(yīng),生成亞硫酸鈉和硫單質(zhì),這兩者都是氧化硫硫桿菌極易利用的還原性物質(zhì)。同時(shí),硫代硫酸鈉和亞硫酸鈉的水解釋放出OH- ,使溶液的pH緩慢上升。在經(jīng)過7天的遲緩期,隨著氧化硫硫桿菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,才開始發(fā)揮其對(duì)硫和還原性含硫化合物的卓著的氧化作用能力而開始產(chǎn)生大量硫酸,使pH值大幅下降。此過程可以用以下反應(yīng)式表示:2S + 3O2 + 2H2O→2H2 SO4
而使用硫做底物時(shí), pH值先是緩慢下降7天左右,然后開始迅速下降. 我們認(rèn)為主要是培養(yǎng)初期細(xì)菌數(shù)量較少,當(dāng)生長(zhǎng)7天后,細(xì)菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,細(xì)菌數(shù)量迅速增加,產(chǎn)生的硫酸相應(yīng)增多,引起pH值迅速降低. 所以這兩種培養(yǎng)基都可以用于氧化硫硫桿菌的培養(yǎng),但是如果使用氧化硫硫桿菌浸礦時(shí),由于它在Waksman培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí),沒有pH值上升的過程, pH值下降更迅速,更有利于浸礦反應(yīng)。
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