一、背景
MC3T3-E1 SUBCLONE 14小鼠顱頂前骨細(xì)胞亞克隆14是從克隆的但是表型各異的MC3T3-E1細(xì)胞系中分離出一系列亞克隆。從含抗壞血酸培養(yǎng)基生長(zhǎng)的成骨細(xì)胞中選擇高或低成骨細(xì)胞分化、礦化的亞克隆。MC3T3亞克隆4（ATCC CRL-2593）和MC3T3亞克隆14（ATCC CRL-2594）在抗壞血酸和3到4mM無機(jī)磷酸鹽中生長(zhǎng)表現(xiàn)出高水平的成骨細(xì)胞分化。它們10天后形成一個(gè)礦化良好的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）。
MC3T3亞克隆24（ATCC CRL-2595）和MC3T3亞克隆30（ATCC CRL-2596）在抗壞血酸中生長(zhǎng)表現(xiàn)出很差的成骨細(xì)胞分化。不形成ECM，可以作為亞克隆4和14的陰性對(duì)照。礦化的亞克隆選擇的表達(dá)作為成骨細(xì)胞標(biāo)記的mRNA，及唾液酸糖蛋白（BSP），骨鈣素（OCN），和甲狀旁腺激素/甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白受體的mRNA。
二、傳代方法
1、盡量吸干凈T25瓶原培養(yǎng)基；
2、加3-4ml常溫PBS輕輕潤(rùn)洗細(xì)胞10-20s，吸走潤(rùn)洗的PBS；
3、T25瓶加1ml左右胰酶，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶以使胰酶鋪勻瓶底細(xì)胞層；
4、將培養(yǎng)瓶放入37度培養(yǎng)箱消化；
5、消化到細(xì)胞間隙變大，但未完全脫落時(shí)加2-3ml完全培養(yǎng)基終止胰酶消化；
6、混勻細(xì)胞，900rpm離心3-5min，棄上清；
7、加新的完全培養(yǎng)基輕輕重懸細(xì)胞，均勻分到新的培養(yǎng)瓶里；
8、補(bǔ)足完全培養(yǎng)基，將培養(yǎng)瓶放回培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)；
三、應(yīng)用
用于維生素B2與牽張力對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化的影響及機(jī)制初步研究：
對(duì)維生素B2與牽張力對(duì)小鼠顱頂前成骨細(xì)胞亞克隆14（MC3T3-E1 subclone 14）成骨分化的影響及機(jī)制進(jìn)行初步探索。
方法：在不同濃度的維生素B2（0μmol/L、0.2μmol/L、1μmol/L、5μmol/L、25μmol/L）作用下培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞（記為維生素B2組）,在不同力值（0%、5%、10%、15%,）0.5 Hz牽張應(yīng)力作用下培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞4h,連續(xù)7天（記為加力組）,上述培養(yǎng)基均為含有成骨誘導(dǎo)液（50 mg/mL抗壞血酸、10mMβ-甘油磷酸鈉）的α-MEM完全培養(yǎng)基。
分別用CCK-8/MTT法檢測(cè)細(xì)胞在不同維生素B2濃度和牽張力值作用下的增殖變化,用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)加力組細(xì)胞的遷移能力,用堿性磷酸酶（ALP）檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞ALP活性的變化,用茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié)形成,用Western blot（WB）檢測(cè)Runx2、OPN、p38、β-catenin等蛋白的表達(dá)情況。
根據(jù)維生素B2組與加力組的檢測(cè)結(jié)果確定適宜維生素B2濃度aμmol/L及適宜力值b%,然后以對(duì)照組、aμmnol/L、b%、aμmol/L+b%分組,用Westem blot（WB）檢測(cè)Runx2、OPN、β-catenin及相關(guān)信號(hào)通路上下游蛋白的表達(dá)情況,來檢測(cè)維生素B2與牽張力共同作用下對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化的影響及可能的機(jī)制。結(jié)果維生素B2組中,CCK-8檢測(cè)顯示維生素B2濃度為0-1μmol/L時(shí)OD值明顯升高（P<0.01）,而濃度為1-25μmol/時(shí)OD值有所下降,但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
維生素B2濃度為1μmol/L時(shí),堿性磷酸酶活性和礦化結(jié)節(jié)生成量都有顯著提高,并且促進(jìn)了Runx2、OPN、β-catenin的表達(dá),但對(duì)p38的表達(dá)無顯著影響（P>0.05）。在加力組中,MTT檢測(cè)OD值顯示在牽張力作用下細(xì)胞增殖能力增強(qiáng),在拉升應(yīng)變率為10%時(shí)達(dá)到最大,并且牽張力能顯著提升細(xì)胞遷移能力。Western blot結(jié)果顯示10%力值能顯著促進(jìn)Runx2、OPN、p38、β-catenin的表達(dá)（P<0.05）,并且力值達(dá)到15%時(shí)促進(jìn)作用減弱。因此選用維生素B2濃度為1μmol/L,牽張力值為10%進(jìn)行第三部分實(shí)驗(yàn)。
結(jié)果證實(shí)了兩者對(duì)促進(jìn)成骨具有協(xié)同作用,并且與Wnt/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)控有關(guān)。結(jié)論適宜濃度的維生素B2和適宜力值的牽張力都能分別促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的成骨向分化,并且兩者間具有一定的協(xié)同作用,而wnt/β-catenin信號(hào)通路可能參了與該過程的調(diào)控。
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