一、背景
C2C12是由D·Yaffe和O·Saxel建立的小鼠成肌細(xì)胞株的亞克隆。C2C12細(xì)胞分化很快，容易形成可伸縮的肌管并生成特征性的肌蛋白。用骨形成蛋白2(BMP-2)處理C2C12細(xì)胞，會(huì)導(dǎo)致C2C12細(xì)胞的分化途徑從成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)換為成骨細(xì)胞。
C2C12作為研究肌肉理想的細(xì)胞模型，在實(shí)驗(yàn)研究中常誘導(dǎo)其分化為多核肌管。成肌分化在肌肉再生中起重要作用，它是通過一種高度協(xié)調(diào)的序列程序來產(chǎn)生成熟的骨骼肌的過程。
二、C2C12細(xì)胞系培養(yǎng)操作
1）復(fù)蘇C2C12細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）C2C12細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗C2C12細(xì)胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察C2C12細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.將細(xì)胞懸液按1：2比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）C2C12細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
下面T25瓶為類；
1.C2C12細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入1ml含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
2.4 min 1000rpm離心去掉上清。加1ml血清重懸細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入血清和DMSO，輕輕混勻，DMSO終濃度為10%，細(xì)胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存1ml細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識。
3.將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，2個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應(yīng)用
C2C12可以用于MOTS-c通過SIRT3誘導(dǎo)C2C12成肌細(xì)胞UPRmt的機(jī)制研究：
MOTS-c是最近發(fā)現(xiàn)的一種由線粒體12S r RNA開放閱讀框編碼的短肽,其主要作用的靶器官是骨骼肌,并且對衰老和SIRT3都具有一定調(diào)節(jié)作用。
本實(shí)驗(yàn)將通過利用魚藤酮、SIRT3-si RNA、SIRT3過表達(dá)和外源性MOTS-c對C2C12成肌細(xì)胞進(jìn)行干預(yù),驗(yàn)證:1)SIRT3是否參與調(diào)控骨骼肌UPRmt生物效應(yīng);2)SIRT3是否能獨(dú)立誘發(fā)UPRmt;3)MOTS-c是否通過SIRT3誘導(dǎo)UPRmt。研究方法:本研究實(shí)驗(yàn)對象為C2C12成肌細(xì)胞,研究共分為三部分。
第一部分驗(yàn)證SIRT3是否參與調(diào)控骨骼肌UPRmt生物效應(yīng),實(shí)驗(yàn)分組為空白對照組(C)、SIRT3-si RNA組(si RNA)、魚藤酮干預(yù)組(ROT)、魚藤酮+SIRT3-si RNA組(ROT+si RNA);
第二部分驗(yàn)證SIRT3是否能獨(dú)立誘發(fā)UPRmt,實(shí)驗(yàn)分組為空質(zhì)粒組(C)、SIRT3過表達(dá)質(zhì)粒組(SIRT3-OE)、魚藤酮陽性對照組(ROT);
第三部分驗(yàn)證MOTS-c是否通過SIRT3誘導(dǎo)UPRmt,實(shí)驗(yàn)分組為空白對照組(C)、SIRT3-si RNA組(si RNA)、外源性MOTS-c孵育組(MOTS-c)、MOTS-c+SIRT3-si RNA組(MOTS-c+si RNA)。用DCFH-DA探針法檢測ROS生成水平。
用JC-1探針法檢測線粒體膜電位水平ΔΨ。用Western-blotting實(shí)驗(yàn)方法檢測UPRmt的氧化損傷通路中Fox O3a、SIRT3和SOD2;UPRmt的線粒體基質(zhì)通路c-Jun、CHOP和HSP60;UPRmt的線粒體膜間腔通路AKT、NRF1和OMI以及對MOTS-c相關(guān)通路AMPK的蛋白表達(dá)水平。
研究結(jié)果：
(1)SIRT3是C2C12成肌細(xì)胞UPRmt激活的必要條件之一與C組比較,ROT組SIRT3、SOD2、c-Jun、CHOP、HSP60、AKT、NRF1和OMI蛋白表達(dá)水平都顯著性升高(P<0.05),Fox O3a蛋白表達(dá)水平顯著性升高(P<0.01)。與ROT組比較,ROT+si RNA組HSP60、AKT和NRF1蛋白表達(dá)水平顯著性降低(P<0.05),Fox O3a、SIRT3、SOD2、c-Jun、CHOP和OMI蛋白表達(dá)水平顯著性降低(P<0.01)。
(2)單純過表達(dá)SIRT3能激活C2C12成肌細(xì)胞UPRmt與C組相比,SIRT3-OE組Fox O3a、SOD2、c-Jun、CHOP、AKT、NRF1和OMI的蛋白表達(dá)水平都顯著性升高(P<0.05)。
(3)外源性MOTS-c通過SIRT3途徑激活C2C12成肌細(xì)胞UPRmt與C組比較,MOTS-c組Fox O3a、SIRT3、SOD2、c-Jun、CHOP、HSP60、AKT、NRF1、OMI和AMPK蛋白表達(dá)水平都顯著性提高(P<0.05)。與MOTS-c組相比,MOTS-c+si RNA組c-Jun、CHOP、AKT、AMPK蛋白表達(dá)水平顯著性降低(P<0.05),Fox O3a、SIRT3、SOD2、HSP60、NRF1和OMI蛋白表達(dá)水平顯著性降低(P<0.01)。
研究結(jié)論：
1、SIRT3是C2C12成肌細(xì)胞UPRmt激活的必要條件之一。
2、單純過表達(dá)SIRT3亦可激活C2C12成肌細(xì)胞UPRmt。
3、外源性MOTS-c可通過SIRT3途徑激活C2C12成肌細(xì)胞UPRmt。
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