一、背景
人整合SV40基因的乳腺上皮細胞由E.V.Gaffney及其同事從一位沒有乳癌家族史的供者乳汁中建立，培養(yǎng)出來的細胞染色體組型在第7代時就不正常；電鏡照片顯示有微絲、張力原纖維和橋粒；Southern轉移表明有整合型SV40病毒基因，不可以當作正常細胞。
二、人整合SV40基因的乳腺上皮細胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備
1）準備DMEM培養(yǎng)基；優(yōu)質胎牛血清，10%；雙抗，1%。
2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。
三、人整合SV40基因的乳腺上皮細胞處理
1）凍存人整合SV40基因的乳腺上皮細胞的復蘇：
將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完全培養(yǎng)基重懸細胞。然后將細胞懸液加入含6-8ml完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況和細胞密度。
2）人整合SV40基因的乳腺上皮細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
對于貼壁人整合SV40基因的乳腺上皮細胞傳代可以參考以下方法：
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細胞可以適當延長消化時間），然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。
3.輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細胞的生長活力，后續(xù)傳代根據實際情況按1:2~1:5的比例進行。
3）人整合SV40基因的乳腺上皮細胞凍存:收到細胞后建議在培養(yǎng)前3代時凍存一批細胞種子以備后續(xù)實驗使用。
四、應用
人整合SV40基因的乳腺上皮細胞可以用于BMP9通過下調CTGF抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231骨轉移：
研究BMP9對乳腺癌細胞骨轉移的作用及其分子機制。
方法：RT-PCR檢測臨床乳腺癌及其癌旁組織,以及轉移能力不同的幾株乳腺癌細胞系中BMP9的表達;以人乳腺癌MDA-MB-231細胞為研究對象,擴增高滴度的BMP9表達腺病毒,感染該細胞,制備高表達BMP9的重組MDA-MB-231/BMP9細胞,以此作為實驗組;同時以含GFP的空載腺病毒感染該細胞制備MDA-MB-231/GFP,聯(lián)合空白MDA-MB-231共同作為對照組;通過平板集落形成實驗、細胞劃痕實驗﹑Transwell侵襲實驗檢測重組MDA-MB-231/BMP9細胞侵襲及遷移能力。
Real Time PCR檢測腫瘤骨轉移相關基因CTGF、ID1、CXCR4在MDA-MB-231/BMP9中的表達;制備CTGF條件培養(yǎng)基刺激MDA-MB-231/BMP9,通過細胞劃痕實驗﹑Transwell侵襲實驗檢測在外源性CTGF蛋白的條件下重組MDA-MB-231/BMP9細胞的侵襲及遷移能力改變。
在裸鼠脛骨骨膜下分別注射上述乳腺癌細胞,制備乳腺癌骨轉移模型,觀察BMP9是否能抑制乳腺癌細胞的骨轉移,免疫組化分析CTGF在轉移骨內的表達改變情況;通過BMP9、CTGF兩種腺病毒共感染MDA-MB-231細胞,制備高表達BMP9和CTGF的重組MDA-MB-231/BMP9/CTGF細胞,以此作為實驗組,同時以MDA-MB-231/BMP9/RFP作為對照組,觀察在CTGF存在的情況下,兩組細胞所致裸鼠長骨溶骨性損傷的差異。
結果：在6對臨床乳腺癌及癌旁組織中,BMP9在其中5例癌組織中表達缺失,而在相應癌旁組織中有較高表達,1例在癌組織和癌旁組織均有表達,但癌旁組織中BMP9表達明顯高于癌組織;在轉移能力不同的乳腺癌細胞系中,高轉移能力的MDA-MB-231中表達缺失,轉移能力低的MCF7和整合SV40的乳腺上皮細胞HBL-100中BMP9有較高表達。
選擇MDA-MB-231細胞作為研究對象,通過體外BMP9腺病毒感染制備高表達BMP9的MDA-MB-231/BMP9重組細胞作為實驗組。與對照組細胞相比,實驗組細胞中BMP9 mRNA表達水平明顯增高;集落形成率由對照的(90.6±2.5)%與(85.6±3.5)%顯著下降至(57.3±4.5)%(P<0.05);劃痕愈合率由對照的(95.4±3.1)%與(92.5±2.4)%下降至(74.0±3.6)%(P<0.05);Transwell實驗中穿膜細胞數由對照的(255.3±16.1)個與(267.3±14.9)個下降至(150.3±14.6)個(P<0.05);定量PCR結果顯示MDA-MB-231/BMP9細胞中腫瘤骨轉移相關基因CTGF表達下調。
通過CTGF條件培養(yǎng)基刺激MDA-MB-231/BMP9細胞,在外源性CTGF蛋白存在的條件下,劃痕實驗結果顯示實驗組MDA-MB-231/BMP9+CTGF細胞劃痕愈合率由對照組MDA-MB-231/BMP9+GFP組的(32.2±1.6)%上升至(85.3±3.1)%(P<0.05),Transwell實驗中穿膜細胞數由對照MDA-MB-231/BMP9+GFP穿膜細胞數(135.8±10.1)個上升至(248.5±21.6)個(P<0.05)。
裸鼠脛骨分別注射實驗組與對照組細胞,制備乳腺癌骨轉移模型,發(fā)現(xiàn)BMP9能顯著抑制乳腺癌MDA-MB-231溶骨性轉移,免疫組化結果顯示CTGF在MDA-MB-231/BMP9所致的轉移骨組織中表達下調(P<0.05),恢復CTGF表達后MDA-MB-231/BMP9/CTGF的溶骨性區(qū)域明顯大于MDA-MB-231/BMP9/RFP組。
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