一、背景
D283 Med細(xì)胞是由Friedman等人于1985年建系，源自一名6歲患有神經(jīng)管細(xì)胞瘤有腹腔轉(zhuǎn)移的白人男性小孩的腹水細(xì)胞。
二、D283 Med細(xì)胞復(fù)蘇、傳代及凍存流程參考：
1、D283 Med細(xì)胞復(fù)蘇
1）配制完全培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基+胎牛血清+雙抗（特殊培養(yǎng)基特殊配置）；
2）D283 Med細(xì)胞復(fù)蘇：取5ml完全培養(yǎng)基于15ml離心管中，37℃水浴鍋預(yù)熱，從液氮管（或者-80度冰箱）中快速取出凍存的細(xì)胞，放入37℃水浴鍋中，搖晃使快速化凍（1min左右），然后將化凍的細(xì)胞和預(yù)熱的培養(yǎng)基，移入超凈工作臺中，化凍的細(xì)胞加入到含預(yù)熱培養(yǎng)基的15ml離心管中，1000rpm離心5min；
3）吸棄上清，得到D283 Med細(xì)胞沉淀，用2ml完全培養(yǎng)基輕輕重懸細(xì)胞，加入到T25培養(yǎng)瓶中，做好標(biāo)記，放入37℃，5%CO2飽和適度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)皿復(fù)蘇效果更好）；
4）24h后，觀察D283 Med細(xì)胞貼壁情況（未貼壁的即為死細(xì)胞--針對貼壁細(xì)胞），吸棄舊培養(yǎng)基，加入新鮮的預(yù)熱（室溫或37℃）的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。
2、D283 Med細(xì)胞傳代
1）待D283 Med細(xì)胞生長到80%-90%匯合度時，吸棄舊的培養(yǎng)基，加入1ml無菌PBS潤洗一次，以去除殘余的培養(yǎng)基及血清（血清含有胰酶的抑制因子），然后加入1ml 0.25%胰酶，37℃培養(yǎng)箱中消化（1~2min左右，不同細(xì)胞消化時間不同），取出細(xì)胞，鏡下觀察細(xì)胞至細(xì)胞皺縮變圓；
2）加入1ml完全培養(yǎng)基（含F(xiàn)BS）終止消化，輕輕拍打，使D283 Med細(xì)胞脫落下來成單個細(xì)胞懸液，收集細(xì)胞于15ml無菌離心管中，1000rpm，離心5min；
3）收集D283 Med細(xì)胞沉淀，完全培養(yǎng)基重懸，一分為二（可根據(jù)細(xì)胞生長速度調(diào)整比例），分別加入到2個新的培養(yǎng)瓶中，做好標(biāo)記，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3、D283 Med細(xì)胞凍存
1）按照D283 Med細(xì)胞傳代方法，在超凈工作臺內(nèi)消化收集細(xì)胞沉淀，取少量細(xì)胞用于計數(shù)；
2）用預(yù)冷的1ml凍存液（90%完全培養(yǎng)基+10%DMSO）或者無血清細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞，加入到1.2ml凍存管中，密度為1*106個/ml。
3）放入程序凍存盒，-80℃過夜后，轉(zhuǎn)入液氮長期保存。
三、應(yīng)用
D283 Med可以用于ATXN1在髓母細(xì)胞瘤和ALDH1在食管癌干性維持與侵襲中的作用及其分子機(jī)制研究：
本研究主要包括以下兩部分內(nèi)容：第一部分ATXN1對髓母細(xì)胞瘤干性與侵襲特性的調(diào)控作用及其分子機(jī)制髓母細(xì)胞瘤(medulloblastoma)是兒童最常見的惡性腦腫瘤，臨床預(yù)后差。使用成球培養(yǎng)法從髓母細(xì)胞瘤中分離/富集了髓母細(xì)胞瘤干細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)其具有高侵襲性及高成瘤能力的特性。
通過本課題組在肺癌和胃癌中對成球細(xì)胞與普通貼壁細(xì)胞的基因表達(dá)譜芯片分析，篩選出ATXN1這個差異性表達(dá)的基因并發(fā)現(xiàn)其在髓母細(xì)胞瘤成球細(xì)胞中高表達(dá)。通過免疫組化染色發(fā)現(xiàn)髓母細(xì)胞瘤中ATXN1的表達(dá)與其臨床預(yù)后密切相關(guān)，因此進(jìn)一步研究了ATXN1在調(diào)控髓母細(xì)胞瘤自我更新及侵襲中的作用及可能的分子機(jī)制。
本部分實(shí)驗(yàn)主要方法、研究結(jié)果及結(jié)論如下：
1、髓母細(xì)胞瘤原代細(xì)胞的培養(yǎng)及細(xì)胞系的建立。為了更好的了解髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性并滿足實(shí)驗(yàn)研究的需要，收集了5例髓母細(xì)胞瘤原代標(biāo)本進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；并且成功建立了一株發(fā)生于成人的髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞系。對建系后的細(xì)胞采用光鏡、電鏡、免疫組化、流式細(xì)胞術(shù)、染色體分析和移植瘤等實(shí)驗(yàn)對細(xì)胞株生物學(xué)特性進(jìn)行了研究。
2、使用成球培養(yǎng)法成功分離/富集髓母細(xì)胞瘤干細(xì)胞，并進(jìn)行了生物學(xué)特性鑒定。
(1) 用無血清的干細(xì)胞培養(yǎng)基對髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞Daoy、ons76和D283培養(yǎng)，三個細(xì)胞均能成球生長；
(2) 實(shí)時定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞球細(xì)胞(sphere cells,SC)較單層培養(yǎng)細(xì)胞(monolayer cell，MN)高表達(dá)干性相關(guān)基因Bmi1、Nanog、Nestin、Oct4和Sox2及基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2、MMP7、MMP9和MMP13；
(3) 免疫熒光檢測表明Daoy-SC高表達(dá)Nestin、Sox2和CD133，低表達(dá)GFAP、MBP和βⅢ-tubulin；
(4) Daoy-SC細(xì)胞于含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時則高表達(dá)GFAP、MBP和βⅢ-tubulin，不表達(dá)Nestin、Sox2和CD133；
(5) Transwell實(shí)驗(yàn)表明Daoy-SC比Daoy-MN具有更強(qiáng)的侵襲能力；
(6) 裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)表明同數(shù)量級的Daoy-SC比Daoy-MN細(xì)胞具有更強(qiáng)的腫瘤形成能力。上述結(jié)果從干性和侵襲相關(guān)基因的表達(dá)、多向分化能力、侵襲和成瘤能力等幾個方面證實(shí)了成球生長的細(xì)胞具有TICs的特性。
3、通過基因芯片篩選出在胃癌和肺癌成球細(xì)胞中均高表達(dá)分子ATXN1，發(fā)現(xiàn)ATXN1在調(diào)控髓母細(xì)胞瘤的遷移、侵襲，自我更新及成瘤能力中均具有重要作用。
(1) 實(shí)時定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)ATXN1在髓母細(xì)胞瘤干細(xì)胞中高表達(dá)；
(2) 利用慢病毒干擾Daoy和ons76細(xì)胞ATXN1的表達(dá)后，可以顯著抑制髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞的遷移、侵襲、克隆形成和成瘤能力；
(3)過表達(dá)ATXN1則增強(qiáng)髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞D283的侵襲和成瘤能力。
北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司的微生物菌種查詢網(wǎng)提供微生物菌種保藏、測序、購買等服務(wù),是中國微生物菌種保藏中心的服務(wù)平臺，并且是集微生物菌種、菌種,ATCC菌種、細(xì)胞、培養(yǎng)基為一體的大型微生物查詢類網(wǎng)站，自設(shè)設(shè)備及技術(shù)的微生物菌種保藏中心！歡迎廣大客戶來詢！