一、背景
大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞是以大鼠主動(dòng)脈為材料經(jīng)過(guò)酶消化制的原代成纖維細(xì)胞細(xì)胞系。血管平滑肌細(xì)胞是許多重大動(dòng)脈疾病的細(xì)胞底物。血管平滑肌細(xì)胞的不斷增長(zhǎng)是損傷性血管病變形成、動(dòng)脈疾病發(fā)展的重要原因。體外培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞是研究在血管病變發(fā)生過(guò)程中細(xì)胞及分子改變的基礎(chǔ)。此外平滑肌細(xì)胞具有產(chǎn)生結(jié)締組織和基質(zhì)的功能，因此動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞是研究動(dòng)脈粥樣硬化、血管成形術(shù)后再狹窄以及高血壓等疾病發(fā)病機(jī)制和防治工作的重要對(duì)象。
二、大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞分離步驟
1、頸椎脫臼處死大鼠，75%酒精浸泡3～5min，無(wú)菌條件下打開(kāi)胸腔，將大鼠左肺向右側(cè)翻轉(zhuǎn)，可見(jiàn)貼于脊柱右側(cè)胸主動(dòng)脈走行。上端沿主動(dòng)脈弓，下端至膈的主動(dòng)脈裂孔處，完整剪取胸主動(dòng)脈，置于預(yù)先裝有PBS的無(wú)菌培養(yǎng)皿中；
2、用鑷子輕輕剝離血管外結(jié)締姐織，移至另一裝有PBS的無(wú)菌培養(yǎng)皿；
3、用眼科剪沿縱軸剪開(kāi)血管條，無(wú)菌鑷輕輕刮除內(nèi)膜，移至另一無(wú)菌培養(yǎng)皿；
4、用鑷子鈍性加壓刮中膜2次，待出現(xiàn)裂口后夾住中膜將其取下；
5、將取下的中膜加入含20%FBS的DMEM培養(yǎng)液，用眼科剪剪碎血管條，使組織塊大小約1mm×1mm×lmm;
6、用無(wú)菌滴管將組織塊吸入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，均勻鋪于瓶壁，間距約0.2～0.5cm;
7、將培養(yǎng)瓶直立放置于37℃/5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱；
8、1h后輕輕放平，37℃/5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中絕對(duì)靜置3d;
9、此后每3d換液1次；
10、培養(yǎng)出來(lái)的VSMC及時(shí)傳代及凍存于液氮，3～8代用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
三、應(yīng)用
大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞可以用于法舒地爾對(duì)大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響及Ras-MEK1/2-ERK1/2通路的作用：
通過(guò)觀察法舒地爾對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的影響并探討其可能的分子生物學(xué)機(jī)制。以求進(jìn)一步了解法舒地爾對(duì)血管再狹窄藥理作用，并期望其能成為預(yù)防治療動(dòng)脈狹窄介入術(shù)后再狹窄的新型藥物。
方法：提取培養(yǎng)SD大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%80%匯合后換用無(wú)血清培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)24h，使細(xì)胞處于靜止期，然后換用含10%FBS的培養(yǎng)液，分別加入不同濃度(1,10,100μmol/L)的法舒地爾孵育48h，收集細(xì)胞用于下列實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)共分為五組：A組：無(wú)血清組；B組：血清組；C組：血清+1μmol/L法舒地爾干預(yù)組；D組：血清+10μmol/L法舒地爾干預(yù)組；E組：血清+100μmol/L法舒地爾干預(yù)組。通過(guò)MTT法，BrdU法及劃痕試驗(yàn)測(cè)定血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移；應(yīng)用流式細(xì)胞法測(cè)定血管平滑肌細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡；應(yīng)用Western免疫印跡法測(cè)定Ras-MEK1/2-ERK1/2以及Akt蛋白通路的磷酸化水平。
結(jié)果：
(1)法舒地爾以劑量依賴性方式抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖與遷移：MTT檢測(cè)結(jié)果表明，法舒地爾可顯著抑制體外培養(yǎng)的VSMC增殖，并具有明顯的量效關(guān)系(P<0.05)。在法舒地爾1,10,100μmol/L范圍內(nèi)，隨著濃度的升高，VSMC的增殖活力逐漸下降，與對(duì)照組相比，分別下降2.04%,8.98%,30.39%(24h);6.17%,23.36%,59.82%(48h)。BrdU檢測(cè)結(jié)果表明，法舒地爾可顯著抑制體外培養(yǎng)的VSMC增殖，并具有明顯的量效關(guān)系(P<0.05)。在法舒地爾1,10,100μmol/L范圍內(nèi)，隨著濃度的升高，VSMC的增殖活力逐漸下降，與血清組相比，分別下降9.94%39.36%49.37%(24h);7.38%,57.26%,70.74%(48h)。
(2)法舒地爾以劑量依賴性方式阻斷細(xì)胞周期從G0/G1期過(guò)度到S期：分別用1、10、100μmol/L法舒地爾作用于VSMC24h,G0/G1期細(xì)胞逐漸增多(5.1%,14.2%,22.4%)，S期細(xì)胞逐漸減少(3.9%，14.8%，19.1%)，表明法舒地兒可抑制血管平滑肌細(xì)胞進(jìn)入S期(P<0.05)。
(3)法舒地爾以劑量依賴性方式抑制血管平滑肌細(xì)胞早期凋亡和晚期細(xì)胞凋亡：法舒地爾對(duì)細(xì)胞凋亡的影響通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定，結(jié)果顯示：1、10、100μmol/L法舒地爾作用VSMC48h,早期凋亡及晚期凋亡細(xì)胞逐漸增多，并隨劑量的增加而遞增。表明法舒地爾可促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞凋亡(P<0.05)。
(4)法舒地爾以劑量依賴性方式通過(guò)抑制Ras-MEK1/2-ERK1/2通路起到其抗增殖效果：通過(guò)10%FBS刺激誘導(dǎo)Ras通路激活后加入法舒地爾，結(jié)果顯示：Ras通路的表達(dá)明顯減少，并呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)(P<0.05)。
作為Ras下游的激酶，我們也檢測(cè)了磷酸化和非磷酸化的MEK1/2和ERK1/2的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示：應(yīng)用法舒地爾后，以劑量依賴的形式抑制了MEK1/2和ERK1/2通路的磷酸化表達(dá)(P<0.05)，另外，P13k-Akt通路也顯示可以介導(dǎo)FBS誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖，法舒地爾是否通過(guò)這一通路起作用在本研究中被調(diào)查，結(jié)果顯示：FBS誘導(dǎo)了Akt的激活，但應(yīng)用法舒地爾后沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其對(duì)Akt磷酸化的抑制效果(P>0.05)。
結(jié)論：法舒地爾通過(guò)對(duì)Ras-MEK1/2-ERK1/2通路的抑制作用以及對(duì)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用實(shí)現(xiàn)對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖的抑制。
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