一、背景
人腎透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞源自一個原發(fā)性透明細(xì)胞癌。人腎透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞(786-O)有微絨毛和橋粒，能在軟瓊脂是生長。人腎透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞(786-O)生成的一個PTH樣的多肽與乳癌和肺癌中的肽相似。這個多肽的N端與PTH相似，活性與PTH相似，分子量為6000道爾頓。
二、人腎透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞培養(yǎng)步驟
1、人腎透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：
1）準(zhǔn)備RPMI-1640培養(yǎng)基；北美胎牛血清，10%；雙抗1%。
2）人腎透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）人腎透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲存。
2、人腎透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞處理：
1）復(fù)蘇人腎透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）人腎透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：
1、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
2、加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3、按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4、將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）人腎透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
下面T25瓶為例；
1、細(xì)胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入2ml完全培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計數(shù)板計數(shù)。
2、1000RPM離心5分鐘去掉上清。用血清重懸浮，加DMSO至最終濃度為10%。加入DMSO后迅速混勻，按每1ml的數(shù)量分配到凍存管中，注意凍存管做好標(biāo)識。
3、將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，至少2個小時以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應(yīng)用
人腎透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞可以用于LY294002抑制PI3K/AKT信號通路對人腎透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響：
應(yīng)用PI3K高特異抑制劑2－（4－嗎啉基）－8－苯基－4氫－1－苯并吡喃－4－酮（LY294002）作用于人腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞系，探討LY294002對人腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制，從而為其臨床治療的研究奠定基礎(chǔ)。
方法：
（1）人腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞系培養(yǎng)，建立細(xì)胞模型。
（2）將對數(shù)生長期的腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞分組培養(yǎng)。用不同藥物濃度的LY294002(5μg/mL,10μg/mL,20μg/mL,40μg/mL)處理腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞,MTT法檢測癌細(xì)胞在不同的作用時間(24h、48h、72h)下的OD值，計算增殖抑制率,繪制腎癌細(xì)胞濃度-抑制率曲線及時間-抑制率曲線。用Hoechst染色法觀察腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞，經(jīng)LY294002(5μg/mL,10μg/mL,20μg/mL,40μg/mL）不同的作用時間(24h、48h、72h)下,細(xì)胞凋亡情況。
（3）采用RT-PCR法分別檢測LY294002在不同濃度及時間點對786-O細(xì)胞處理后細(xì)胞的PI3K、mTOR、Akt mRNA的表達(dá)情況，探討其對PI3K、mTOR、Akt mRNA表達(dá)的影響，及其對786-O細(xì)胞增殖的影響。
結(jié)果：
（1）通過MTT法檢測LY294002在24、48、72h均表現(xiàn)出增殖抑制作用，當(dāng)LY294002濃度從1μg/mL增加到40μg/mL時，作用24h細(xì)胞抑制率從6%增加到55%，作用48h時，細(xì)胞抑制率從12%增加到78%，作用72h時細(xì)胞抑制率從14%增加到84%，同一時間不同濃度的各組細(xì)胞與陰性對照組相比，抑制率有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或0.01），提示隨著LY294002濃度的增加，其抑制786-O細(xì)胞增殖的作用逐漸增加。用倒置顯微鏡下觀察LY294002用藥對786-O細(xì)胞生長及形態(tài)的影響，各濃度LY294002作用48h時細(xì)胞形態(tài)變化最為典型。結(jié)果顯示，相對于正常細(xì)胞，LY294002可以令細(xì)胞生長受到不同程度的抑制，表現(xiàn)出濃度依賴性變化。正常細(xì)胞的形態(tài)整齊，邊緣清晰，細(xì)胞排列緊密，而隨藥物濃度的增加，藥物作用下細(xì)胞變圓漂浮無法正常貼壁，細(xì)胞固縮，細(xì)胞密度減少。
（2）通過Hoechst染色法在熒光顯微鏡下觀察對照組細(xì)胞核呈彌散均勻淡藍(lán)色的熒光；出現(xiàn)細(xì)胞凋亡時，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見濃染致密的顆粒塊狀亮藍(lán)色熒光；相對于未經(jīng)藥物處理的786-0細(xì)胞，1μg/mL的藥物處理48h后，細(xì)胞形態(tài)還未出現(xiàn)明顯的變化；2.5μg/mL藥物處理可見個別細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)染色質(zhì)凝聚，出現(xiàn)凋亡小體；5μg/mL藥物處理染色質(zhì)熒光增強(qiáng)，出現(xiàn)凋亡小體的細(xì)胞增多；10μg/mL藥物處理可見凋亡前期的細(xì)胞進(jìn)一步增多；20μg/mL藥物處理可見凋亡小體突破細(xì)胞膜開始釋放；40μg/mL藥物處理可見大部分細(xì)胞凋亡小體釋放，完成凋亡。
（3）在LY294002處理細(xì)胞48h，采用1、2.5、5、10、20、30、40μg/mL濃度處理下，PI3K、Akt、mTOR mRNA的表達(dá)顯著受到抑制，并且呈現(xiàn)出隨藥物濃度的變化出現(xiàn)抑制程度增大的正比關(guān)系；細(xì)胞增殖實驗顯示隨著藥物濃度及其作用時間的延長，其抑制腫瘤作用逐漸增加。
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