一、背景
小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞是一種廣泛用于成骨細(xì)胞學(xué)研究的細(xì)胞系。該細(xì)胞系最早是由美國國立衛(wèi)生研究院的納爾遜博士在1970年代初從小鼠胚胎組織中分離出來的。這些細(xì)胞具有較強(qiáng)的成骨分化能力，在細(xì)胞培養(yǎng)條件下能夠分化成成熟的骨細(xì)胞，并表達(dá)骨特異性基因。因此，小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞成為了研究骨細(xì)胞生物學(xué)、骨代謝、骨肉瘤等方面的理想模型。
二、小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞培養(yǎng)操作
1)復(fù)蘇小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。
將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2)小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
b、加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細(xì)胞懸液按1：2比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3)小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
下面T25瓶為例；
a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。
b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應(yīng)用
小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞可以用于MicroRNA-92a-1-5p調(diào)控小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞成骨分化的作用機(jī)制研究：
探究miR-92a-1-5p是否通過Wnt/β3-catenin信號通路調(diào)控MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化,并闡述miR-92a-1-5p發(fā)揮調(diào)控作用的分子機(jī)制。
研究方法：
1、miR-92a-1-5p在BMP-2誘導(dǎo)MC3T3-E1成骨分化中的影響
(1)使用BMP-2誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞進(jìn)行成骨分化,通過qRT-PCR和Western Blot檢測誘導(dǎo)前后miR-92a-1-5p、ALP、Runx-2、OSX的表達(dá)水平。
(2)采用MTT法檢測誘導(dǎo)前后MC3T3-E1細(xì)胞的增殖情況。
(3)在MC3T3-E1細(xì)胞中構(gòu)建miR-92a-1-5p過表達(dá)或低表達(dá)模型,采用qRT-PCR檢測過表達(dá)或干擾效率,以及ALP、Runx-2,OSX的表達(dá)情況,采用堿性磷酸酶試劑盒檢測ALP的活性。
(4)在MC3T3-E1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-92a-1-5p mimics或inhibitor,再誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化7天,通過茜素紅S法染色檢測成骨分化能力。
2、miR-92a-1-5p調(diào)控β-catenin抑制MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化的作用機(jī)制研究
(1)結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研、生物信息學(xué)和在線數(shù)據(jù)庫分析預(yù)測miR-92a-1-5p的下游靶基因。
(2)在MC3T3-E1細(xì)胞中構(gòu)建miR-92a-1-5p過表達(dá)或低表達(dá)模型,采用qRT-PCR、Western Blot檢測β-catenin的表達(dá)水平。
(3)在MC3T3-E1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-92a-1-5p mimics,再加入氯化鋰(Licl)干預(yù)48h,采用qRT-PCR檢測細(xì)胞中ββ-catenin、ALP、Runx-2、OSX的表達(dá)水平。
(4)在MC3T3-E1細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染miR-92a-1-5p mimics和GSK-3ββsiRNA,采用qRT-PCR、Western Blot檢測β-catenin、Runx-2、ALP、OSX的表達(dá)水平。
(5)在MC3T3-E1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-92a-1-5p mimics,再加入氯化鋰(Licl)干預(yù)48h,然后再誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化7天,通過ARS染色檢測成骨分化能力。
研究結(jié)果：
1、miR-92a-1-5p在BMP-2誘導(dǎo)MC3T3-E1成骨分化中的影響
(1)使用BMP-2能夠成功誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化,隨著誘導(dǎo)時間的延長,細(xì)胞中miR-92a-1-5p的表達(dá)水平逐漸下調(diào),而成骨分化相關(guān)因子ALP、Runx-2,OSX的mRNA的表達(dá)水平逐漸上調(diào)。
(2)誘導(dǎo)后MC3T3-E1細(xì)胞的形態(tài)為紡錘形、類長梭形或多角形,細(xì)胞核變大,但增殖能力比誘導(dǎo)前減弱。
(3)轉(zhuǎn)染了miR-92a-1-5pmimics后,細(xì)胞中成骨分化相關(guān)因子ALP、Runx-2,OSX的表達(dá)水平明顯下調(diào),細(xì)胞中ALP的活性也明顯減弱;;而轉(zhuǎn)染了miR-92a-1-5p inhibitor后,細(xì)胞中成骨分化相關(guān)因子ALP、Runx-2,OSX的表達(dá)水平明顯上調(diào),細(xì)胞中ALP的活性增強(qiáng)。
(4)在MC3T3-E1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了miR-92a-1-5p mimics并誘導(dǎo)成骨分化7天后細(xì)胞內(nèi)形成的礦化結(jié)節(jié)明顯減少,而轉(zhuǎn)染了miR-92a-1-5pinhibitor并誘導(dǎo)成骨分化7天后,細(xì)胞內(nèi)形成的礦化結(jié)節(jié)明顯增加。
2、miR-92a-1-5p調(diào)控β3-catenin抑制MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化的作用機(jī)制研究
(1)分析預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-92a-1-5p可以與β-catenin的3’URT區(qū)域結(jié)合,說明miR-92a-1-5p的下游靶基因是β-catenin。
(2)轉(zhuǎn)染了miR-92a-1-5p mimics后,細(xì)胞中β-catenin的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào);而轉(zhuǎn)染了miR-92a-1-5p inhibitor后,β-catenin的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)。
(3)在MC3T3-E1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了miR-92a-1-5p mimics后,細(xì)胞中β-catenin和成骨分化相關(guān)因子ALP、Runx-2、OSX的表達(dá)水平明顯下調(diào),而再加入氯化鋰(Licl)干預(yù)后,細(xì)胞中β-catenin和成骨分化相關(guān)因子ALP、Runx-2、OSX的表達(dá)水平明顯上調(diào),顯示Licd可以部分逆轉(zhuǎn)miR-92a-1-5p對細(xì)胞中ββ-catenin和成骨分化相關(guān)因子表達(dá)的抑制作用。
(4)在MC3T3-E1細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染了miR-92a-1-5p mimics和si-NC后,細(xì)胞中β-catenin、Runx-2蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào),成骨分化相關(guān)因子ALP、Runx-2、OSX的mRNA的表達(dá)水平也明顯下調(diào);而在MC3T3-E1細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染miR-92a-1-5p mimics和si-GSK-3β后,細(xì)胞中ββ-catenin、Runx-2的蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào),成骨分化相關(guān)因子ALP、Runx-2、OSX的mRNA的表達(dá)水平發(fā)生了上調(diào),顯示miR-92a-1-5p mimics可能與GSK-3β的作用一樣,可以抑制下游靶基因ββ-catenin的表達(dá)。
(5)在MC3T3-E1細(xì)胞中成功轉(zhuǎn)染miR-92a-1-5pmimics,再加入氯化鋰(Licl)干預(yù)48h,然后再誘導(dǎo)成骨分化7天后,與轉(zhuǎn)染miR-92a-1-5p mimics相比,MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化能力得到了增強(qiáng)。
結(jié)論：miR-92a-1-5p可以通過Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控其關(guān)鍵蛋白β-catenin的表達(dá),進(jìn)而抑制MC3T3-E1細(xì)胞中成骨分化關(guān)鍵因子Runx-2、ALP、OSX的表達(dá),最終抑制MC3T3-E1細(xì)胞的成骨分化。
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