一、背景
人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤是1974年R.M.McFall和T.W.Sery建立的兩株人眼癌細(xì)胞系中的一株。細(xì)胞能在Difco Bacto-Agar中存活但不形成克隆。掃描電鏡顯示在表面囊泡，板狀偽足和微絨毛在數(shù)量上和頻率上的改變。細(xì)胞分化研究，腫瘤治療的動(dòng)物模型和生化評(píng)價(jià)都涉及這株細(xì)胞。
二、人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞培養(yǎng)方法
1、人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞傳代：人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代
①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；
②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆蓋整個(gè)瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；
③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入完全培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；
④將人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；
⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；
⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。
2、人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞復(fù)蘇：
①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時(shí)間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。
②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。
3、人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種
①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶（T25瓶）
②1-2min后，顯微鏡下觀察人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入完全培養(yǎng)基終止消化；
③將人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；
④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲(chǔ)存。
三、應(yīng)用
人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤可以用于雙氫楊梅樹皮素誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞氧化及凋亡的研究：
通過檢測雙氫楊梅樹皮素(APS)對(duì)體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞株(HXO-RB44)增殖的影響,觀察細(xì)胞凋亡、線粒體跨膜電位、細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的變化,探討APS誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(RB)細(xì)胞凋亡的氧化作用機(jī)制。
方法：取對(duì)數(shù)生長期的人HXO-RB44進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
1、觀察APS干預(yù)下細(xì)胞的生長曲線:設(shè)7個(gè)不同藥物濃度(50.00、33.33、22.22、14.84、9.90、6.60、4.40)μg/ml和空白對(duì)照組,分別作用0、24、48、72h后,繪制生長曲線圖。
2、觀察APS對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用:7個(gè)濃度的APS干預(yù)RB細(xì)胞24h后,觀察其形態(tài)學(xué)變化,MTT法、軟瓊脂克隆形成法觀察RB細(xì)胞的體外抑制作用。
3、AO/EB染色觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化:選取3個(gè)不同濃度(50.00、14.84、4.40)μg/ml的APS干預(yù)RB細(xì)胞24h后,染色,熒光顯微鏡觀察,并拍照。
4、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡:設(shè)3個(gè)藥物濃度組(50.00、14.84、4.40)μg/ml和空白對(duì)照組,作用24h后,用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。5.流式細(xì)胞儀檢測線粒體跨膜電位及ROS的變化:選取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞培養(yǎng),設(shè)3個(gè)藥物濃度組和空白對(duì)照組培養(yǎng)24h后,染色,流式細(xì)胞儀檢測線粒體跨膜電位及ROS的變化。
結(jié)果：
1、APS干預(yù)后,RB細(xì)胞的生長受到明顯抑制,隨著藥物濃度的增加呈劑量依賴性;作用24h時(shí)抑制作用最明顯。
2、通過倒置顯微鏡可觀察到RB細(xì)胞出現(xiàn)形態(tài)學(xué)的變化。細(xì)胞的IC50為14.71μg/ml;藥物濃度為9.9μg/ml以上時(shí)單細(xì)胞克隆形成抑制率為100﹪,藥物濃度為4.4μg/ml,抑制率為52.2﹪。
3、AO/EB熒光染色,藥物作用后出現(xiàn)了明顯的凋亡細(xì)胞,表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮、核染色質(zhì)濃縮、核碎裂等凋亡特征性的形態(tài)學(xué)改變。
4、APS對(duì)細(xì)胞凋亡有明顯的誘導(dǎo)作用。藥物作用24h后的凋亡率分別為88.13%、58.46%、14.83%,各濃度組凋亡率與空白對(duì)照組(4.82%)比較,差異均有顯著性(P<0.05),各濃度組細(xì)胞凋亡率之間差異也均有顯著性(P<0.05)。
5、APS能降低RB細(xì)胞線粒體跨膜電位。APS處理24h后不同濃度組(50.00、14.84、4.40、0)μg/ml的平均熒光強(qiáng)度分別為20.70、55.63、88.57和146.53,藥物組與空白對(duì)照組比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01),三個(gè)濃度之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
6、APS能促進(jìn)RB細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。APS處理24h后不同濃度組(50.00、14.84、4.40、0)μg/ml的平均熒光強(qiáng)度分別為54.87、43.03、36.80和20.93,藥物組與空白對(duì)照組比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01),三個(gè)濃度之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
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