一、背景
人腎癌WILMS細(xì)胞來源于一名3個(gè)月大的嬰兒的腎Wilms瘤，由于該類腫瘤分類的改變，經(jīng)Garvin等鑒定后發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞來源于腎橫紋肌樣瘤；G-401細(xì)胞分泌腎母細(xì)胞生長因子(NB-GF)。
二、人腎癌WILMS細(xì)胞培養(yǎng)步驟
1、培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：
1）準(zhǔn)備人腎癌WILMS細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(GIBCO，，添加NaHCO3 1.5g/L，丙酮酸鈉0.11g/L)；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%。
2）人腎癌WILMS細(xì)胞培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）人腎癌WILMS細(xì)胞凍存液：90%完全培養(yǎng)基，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲存。
2、人腎癌WILMS細(xì)胞處理：
1）復(fù)蘇人腎癌WILMS細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）人腎癌WILMS細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：
1、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
2、加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3、按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4、將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）人腎癌WILMS細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。貼壁細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后加入少量胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入約1ml含血清的培養(yǎng)基后加入凍存管中，再添加10%DMSO后進(jìn)行凍存。
三、應(yīng)用
人腎癌WILMS細(xì)胞可以用于吳茱萸堿誘導(dǎo)人腎癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制研究：
吳茱萸堿(Evodiamine,EVO)是一種從吳茱萸(Evodia rutaecarpa)果實(shí)中分離得到的吲哚喹唑啉類生物堿。數(shù)千年來,它被認(rèn)為是一種有效的中藥,可用于治療胃病,高血壓和濕疹。在過去的十年中,越來越多的證據(jù)表明EVO可以表現(xiàn)出各種生物活性,包括抗菌、減肥和抗真菌活性。最近,已經(jīng)確定EVO對胃腺癌、結(jié)腸(lovo細(xì)胞系)、結(jié)腸直腸癌和乳腺癌細(xì)胞具有抗腫瘤活性。
先前的研究表明EVO可以抑制癌細(xì)胞的增殖,侵襲和轉(zhuǎn)移,然而針對癌細(xì)胞的作用機(jī)制仍有待闡明,并且尚未報(bào)道EVO在體外人腎癌中的功能研究。在本研究中,進(jìn)行了細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)和轉(zhuǎn)錄組分析研究,揭示了EVO的抗癌機(jī)制。
首先,在EVO處理下進(jìn)行一系列人腎癌786-0細(xì)胞和Caki-1細(xì)胞和人腎上皮細(xì)胞系HK-2細(xì)胞活力和增殖的實(shí)驗(yàn)。然后,使用轉(zhuǎn)錄組分析研究來分析有關(guān)生長和凋亡的EVO-調(diào)節(jié)的基因和信號傳導(dǎo)途徑。此外,使用超微結(jié)構(gòu)觀察,流式細(xì)胞術(shù)和qPCR驗(yàn)證了EVO抑制生長和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。
我們發(fā)現(xiàn)EVO在體外不僅可以改變腎癌細(xì)胞形態(tài)并以時(shí)間和劑量依賴性方式抑制細(xì)胞的活力和增殖能力。另外,轉(zhuǎn)錄組分析表明EVO可以調(diào)節(jié)Caki-1細(xì)胞系的轉(zhuǎn)錄組。
共發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因7243個(gè),其中下調(diào)基因3347個(gè),上調(diào)基因3896個(gè),主要涉及細(xì)胞遷移、凋亡、細(xì)胞周期和DNA復(fù)制等。此外,我們證明EVO可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,使細(xì)胞停滯在G2/M期并且調(diào)節(jié)Caki-1細(xì)胞中細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期相關(guān)基因的基因表達(dá)。
研究通過細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)探究EVO的抗腎癌作用,并表明EVO作為一種潛在的資源有望應(yīng)用到腎癌治療中。
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