一、背景
急性髓系細胞白血病細胞由H.P.Koeffler和D.W.Golde建立。骨髓抽自一個59歲的患有紅白血病而后又發(fā)展成急性骨髓原性白血病的男性白人。KG1細胞在形態(tài)上類似急性髓原白血病，表現(xiàn)為明顯的多形化，骨髓母細胞和骨髓細胞占優(yōu)勢。少量細胞是成熟的粒細胞，也有微量的巨噬細胞和嗜曙紅細胞。
二、急性髓系細胞白血病細胞培養(yǎng)操作規(guī)程
1、急性髓系細胞白血病細胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：
1）急性髓系細胞白血病細胞完全培養(yǎng)基：IMDM+20%FBS++1%雙抗
2）急性髓系細胞白血病細胞培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%
3）急性髓系細胞白血病細胞凍存液：70%IMDM，20%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。
2、急性髓系細胞白血病細胞處理：
1）復蘇急性髓系細胞白血病細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，加入5mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
2）急性髓系細胞白血病細胞傳代：當細胞密度達到1X106/mL時即進行傳代培養(yǎng)
1.將培養(yǎng)瓶中細胞輕輕吹打后吸出，移入15ml離心管中，在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液。
2.按照2-4X105/mL細胞量密度用新鮮培養(yǎng)基重懸細胞，按照上述推薦接種密度將5mL新鮮培養(yǎng)液移入到T-25培養(yǎng)瓶中或15mL新鮮培養(yǎng)液移入到T-75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
3.每間隔2-3天對細胞進行換液或傳代培養(yǎng)。
3）急性髓系細胞白血病細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。懸浮細胞直接計數(shù)后離心，用70%IMDM+20%FBS+10%DMSO凍存液重懸細胞沉淀，按每1ml的數(shù)量分配到凍存管中
三、應(yīng)用
急性髓系細胞白血病細胞可以用于基于RNA-Seq技術(shù)探討三氧化二砷對人急性髓系白血病細胞（KG-1a）基因表達的影響：
研究三氧化二砷(arsenic trioxide,ATO)對急性髓系白血病KG-1a細胞增殖,周期和凋亡的影響,并且利用RNA-Seq技術(shù)篩選與三氧化二砷作用密切相關(guān)的應(yīng)答基因,為闡明三氧化二砷的作用機制提供實驗證據(jù)。
方法：
1、采用CCK-8法檢測ATO對KG-1a細胞增殖的影響。
2、采用流式細胞術(shù)檢測ATO對KG-1a細胞凋亡的影響。
3、采用流式細胞術(shù)檢測ATO對KG-1a細胞周期的影響。
4、采用RNA-Seq技術(shù)獲取ATO 2μmol/L組和control組的差異基因(DEGs)。
5、采用GO及KEGG進行生物功能富集分析。
6、利用String、Cytoscape構(gòu)建DEGs的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)并篩選Hub gene;
7、采用熒光定量PCR技術(shù)驗證m RNA水平表達情況；
8、采用蛋白印跡技術(shù)驗證蛋白水平表達情況。
結(jié)果：
1、CCK-8結(jié)果顯示ATO濃度在3μmol/L以下,不同濃度組間抑制率差異具有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)。
2、流式細胞術(shù)檢測凋亡的結(jié)果顯示,當ATO濃度在1.5μmol/L-3μmol/L之間,加藥組細胞的凋亡率和對照組進行比較,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
3、流式細胞術(shù)檢測細胞周期的結(jié)果表明,周期分布的變化主要集中在G2/M期。隨著ATO濃度的增加,G2/M期細胞所占比例呈現(xiàn)上升趨勢,和對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
4、經(jīng)RNA-Seq分析,篩選到的差異基因共有5371個,上調(diào)的有2666個,下調(diào)的有2705個。
5、GO富集結(jié)果顯示,上調(diào)的差異基因主要參與以下生物學過程:對未折疊蛋白的反應(yīng)和對拓撲錯誤蛋白的反應(yīng),粒細胞活化以及介導的免疫反應(yīng),解毒過程,自噬以及自噬的調(diào)節(jié)等過程;下調(diào)的差異基因富集到的生物學過程條目主要涉及核糖核酸蛋白復合體生物發(fā)生,DNA復制,DNA生物合成,甲基化,細胞周期G1/S相轉(zhuǎn)變,通過端粒酶進行端粒維護等過程。
6、KEGG富集的結(jié)果顯示,上調(diào)的差異基因主要參與以下信號通路:吞噬體,細胞色素P450對外來物質(zhì)的代謝作用,溶酶體,過氧化物酶體,谷胱甘肽代謝,氨基糖和核苷酸糖代謝,礦物質(zhì)吸收,自噬,化學致癌作用,PPAR通路等相關(guān)信號通路;下調(diào)的差異基因主要參與真核生物中的核糖體生成,嘌呤及嘧啶代謝,RNA轉(zhuǎn)運,細胞周期,剪接體,人T細胞白血病病毒Ⅰ型感染,DNA復制,RNA聚合酶,TGF-β通路等相關(guān)通路。
7、PPI互作網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示,核心網(wǎng)絡(luò)節(jié)點基因有MYC、MCM7和PCNA。
8、熒光定量PCR結(jié)果表明,在KG-1a細胞和其他三種AML細胞株中,差異基因(MYC、MCM7、PCNA、BCL2L1、CCNE1、BAX、BAD、CDKN1A、CDKN1C和CDKN3)m RNA的表達水平和RNA-seq的結(jié)果具有一致性。
9、蛋白印跡實驗結(jié)果表明,在KG-1a細胞和其他三種AML細胞株中,MYC、MCM7、PCNA、BCL2L1、BAX、BAD、P21和P57蛋白的表達水平和RNA-seq的結(jié)果具有一致性。
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