一、背景
小鼠淋巴細(xì)胞白血病是由G.Moore等（1966）和P.Himmelfarb等（1967）報(bào)導(dǎo)。此細(xì)胞系廣泛用于化學(xué)因子和天然產(chǎn)物細(xì)胞毒活性的常規(guī)篩選。接種裸鼠在21天內(nèi)100%（5/5）成瘤。
二、小鼠淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞培養(yǎng)條件
1、大小鼠淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞培養(yǎng)基：RPMI-1640培養(yǎng)基（不含Hepes）+10%胎牛血清+1%雙抗+800ng/ml Taxol
2、溫度：37.0°C
3、氣體:空氣95%，CO2 5%
三、小鼠淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞培養(yǎng)步驟
（一）小鼠淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加4-6mL完全培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6cm皿中），培養(yǎng)過(guò)夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
（二）小鼠淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對(duì)于小鼠淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞，傳代可參考以下方法：
1、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗小鼠淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞1-2次。
2、加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的完全培養(yǎng)基終止消化。
3、輕輕吹打小鼠淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞，完全脫落后吸出，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4、按5-6ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)液，將JeKo-1細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新的含5-6 ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中。
（四）小鼠淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞凍存：
1、小鼠淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時(shí)，棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞一次；
2、添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待小鼠淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞回縮變圓后加入完全培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打細(xì)胞使之脫落，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1000rpm離心5min；
3、用適量的凍存液重懸小鼠淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞，并放置于凍存管中；
4、先將小鼠淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞凍存管放置于-20℃1.5h，然后將其移入-80℃。
四、應(yīng)用
小鼠淋巴細(xì)胞白血病可以用于AS2O3對(duì)L1210細(xì)胞增殖、凋亡及自噬的影響：
將As2O3應(yīng)用于治療M3型急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL),之后又發(fā)展到治療維甲酸治療緩解后復(fù)發(fā)的M3型患者,完全緩解率達(dá)93%以上,已被公認(rèn)為M3型白血病治療首選藥物。一般認(rèn)為As2O3治療APL的主要機(jī)制是誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡,很少考慮其對(duì)細(xì)胞自噬的影響。
本研究從As2O3對(duì)L1210細(xì)胞增殖、凋亡及自噬的影響,探討其抗白血病的更可能的隱藏機(jī)制。本研究采用MTT法及Brdu-Elisa法測(cè)定不同濃度As2O3對(duì)L1210細(xì)胞增殖的影響,流式細(xì)胞術(shù)及AO/EB雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡,AO染色及MDC染色檢測(cè)細(xì)胞自噬,免疫印跡法檢測(cè)增殖相關(guān)蛋白PCNA、凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、自噬相關(guān)蛋白LC3B的表達(dá)。
另用苯誘導(dǎo)的小鼠再生障礙性貧血模型檢測(cè)As2O3是否能刺激骨髓細(xì)胞的造血功能。
細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:As2O3對(duì)L1210白血病細(xì)胞呈劑量、時(shí)間依賴性生長(zhǎng)抑制作用,24h、48h、72h半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為11.61μmol/L±0.05、3.34μmol/L±0.03、0.13μmol/L±0.08。As2O3作用24h,細(xì)胞凋亡率隨著As2O3濃度的升高而升高,5、10、20μmol/L的凋亡率分別為26.52%±0.02、30.99%±0.06、74.48%±0.05。AO/EB雙染法可觀察到細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化,如細(xì)胞核濃縮、凋亡細(xì)胞表面膜出泡、體積變小、細(xì)胞破裂并出現(xiàn)凋亡小體等形態(tài)學(xué)特征,并呈劑量依賴性。AO染色及MDC染色可觀察到自噬陽(yáng)性顯色,且藥物濃度越高,陽(yáng)性率越高。
Western-blot結(jié)果顯示:As2O3能上調(diào)自噬相關(guān)蛋白LC3B、促凋亡蛋白BAX的表達(dá)水平,使細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白PCNA、抑制凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)下降,并程劑量依賴性。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明,As2O3能使再障小鼠外周血細(xì)胞數(shù)量、骨髓細(xì)胞數(shù)量、網(wǎng)織紅細(xì)胞絕對(duì)值、血紅蛋白含量增高,改善肝、腎組織的損傷情況。
綜上所述,As2O3通過(guò)誘導(dǎo)L1210細(xì)胞凋亡及自噬的產(chǎn)生來(lái)達(dá)到治療淋巴細(xì)胞白血病,能刺激再障小鼠骨髓細(xì)胞的造血功能。
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