一、細(xì)胞簡(jiǎn)介
平臺(tái)編號(hào)：Bio-73706
規(guī)格：1×10?Cells/T25培養(yǎng)瓶
細(xì)胞信息：原代細(xì)胞
細(xì)胞名稱：大鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞
培養(yǎng)條件：原代細(xì)胞取組織現(xiàn)分
用途：研究
注意事項(xiàng)：僅用于科學(xué)研究或者工業(yè)應(yīng)用等非醫(yī)療目的不可用于人類或動(dòng)物的臨床診斷或治療，非藥用，非食用（產(chǎn)品信息以出庫(kù)為準(zhǔn)）
二、細(xì)胞詳述
心臟是脊椎動(dòng)物身體中最重要的一個(gè)器官，主要功能是提供壓力，把血液運(yùn)行至身體各個(gè)部分。心臟的作用是推動(dòng)血液流動(dòng)，向器官、組織提供充足的血流量，以供應(yīng)氧和各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并帶走代謝的終產(chǎn)物（如二氧化碳、無機(jī)鹽、尿素和尿酸等），使細(xì)胞維持正常的代謝和功能。
微血管內(nèi)皮細(xì)胞呈單層覆蓋于微血管表面，構(gòu)成血管內(nèi)外物質(zhì)交換的一種重要屏障，是循環(huán)血流動(dòng)力和血液中危險(xiǎn)因素的主要靶點(diǎn)。
三、細(xì)胞特性
1）組織來源于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的正常心臟組織。
2）細(xì)胞鑒定：vWF免疫熒光染色為陽性。
3）經(jīng)鑒定細(xì)胞純度高于90%。
4）不含有 HIV-1、 HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌。
5）細(xì)胞生長(zhǎng)方式：多角形細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)。
四、產(chǎn)品的運(yùn)輸和保存
視天氣狀況和運(yùn)輸距離遠(yuǎn)近，公司與客戶協(xié)商后選擇下述方式中的一種進(jìn)行。
1)1mL凍存細(xì)胞懸液裝于1.8ml的凍存管中，置于裝滿干冰的泡沫保溫盒中進(jìn)行運(yùn)輸；收到細(xì)胞后請(qǐng)盡快解凍復(fù)蘇細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，如無法立刻進(jìn)行復(fù)蘇操作，凍存細(xì)胞可在-80℃的條件下保存1個(gè)月。
2)T-25培養(yǎng)瓶充滿完全培養(yǎng)基后進(jìn)行常溫運(yùn)輸；收到細(xì)胞后請(qǐng)鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，如鋪瓶率超過85%請(qǐng)立即進(jìn)行傳代操作，如懸浮的細(xì)胞較多，請(qǐng)將培養(yǎng)瓶至于培養(yǎng)箱中靜置過夜以幫助未死亡的懸浮細(xì)胞能夠再次貼壁。
五、產(chǎn)品使用
1)本產(chǎn)品僅能用于科研
2)本產(chǎn)品未通過直接用于活體動(dòng)物和人的審核
3)本產(chǎn)品未通過用于活體診斷的審核
六、技術(shù)背景
大鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞分離自心臟組織；心臟是脊椎動(dòng)物身體中最重要的一個(gè)器官，主要功能是為血液流動(dòng)提供壓力，把血液運(yùn)行至身體各個(gè)部分。心臟由心肌構(gòu)成，左心房、左心室、右心房、右心室四個(gè)腔組成。左右心房之間和左右心室之間均由間隔隔開，故互不相通，心房與心室之間有瓣膜（房室瓣），這些瓣膜使血液只能由心房流入心室，而不能倒流。
心臟的作用是推動(dòng)血液流動(dòng)，向器官、組織提供充足的血流量，以供應(yīng)氧和各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并帶走代謝的終產(chǎn)物（如二氧化碳、無機(jī)鹽、尿素和尿酸等），使細(xì)胞維持正常的代謝和功能。心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞是組成心臟微血管腔面單層扁平上皮樣細(xì)胞，它所產(chǎn)生和分泌的生物活性物質(zhì)對(duì)維持血管張力、調(diào)節(jié)血壓、抗血栓形成等有重要作用，在心臟血管疾病的發(fā)病機(jī)制中有重要病理生理學(xué)意義。
近年來大量研究表明，心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能和病理改變直接影響心肌細(xì)胞功能，也是諸多毒素、炎癥因子及病毒等重要靶位，其作為體外研究的細(xì)胞模型在心肌缺血-再灌注發(fā)病機(jī)制和細(xì)胞間旁分泌細(xì)胞生長(zhǎng)因子研究中起著重要作用。大鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞采用膠原酶-中性蛋白酶混合消化法結(jié)合密度梯度離心法、最后通過內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來，細(xì)胞總量約為5×10^5cells/瓶；細(xì)胞經(jīng)CD31/vWF免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等。
大鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)：用1～4d sd大鼠全身經(jīng)體積分?jǐn)?shù)75%的酒精消毒后，仰臥位固定于無菌操作臺(tái)上(以下步驟均為無菌操作。開胸，剝離心包膜，取心臟下1/3，置于盛有預(yù)冷(4℃pbs的小瓶中，洗盡血液，浸入體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇中10s以滅活心外膜和心內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞。預(yù)冷pbs沖洗，剪碎心肌組織，加入10倍體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的胰蛋白酶，37℃消化5min。
輕輕吹打，靜置1min后吸取上層液體(為分離出的內(nèi)皮細(xì)胞(余下組織塊用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%胰蛋白酶再消化5min，再收集上層液體用預(yù)冷的含體積分?jǐn)?shù)15%小牛血清的培養(yǎng)基滅活殘留胰酶活性。1000r/min，4℃離心10min收集細(xì)胞。將細(xì)胞重懸于含體積分?jǐn)?shù)20%小牛血清m199培養(yǎng)基(內(nèi)含100u/l青霉素、100mg鏈霉素、10mmol/l hepes、2mmol/l l_谷氨酰胺，200目篩網(wǎng)過濾，得到細(xì)胞混懸液，接種于培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng)30min以使成纖維細(xì)胞貼壁(重復(fù)此操作可提高細(xì)胞純度。
轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液，混勻后計(jì)數(shù)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?，調(diào)整細(xì)胞密度至合適濃度，接種于培養(yǎng)瓶、96孔培養(yǎng)板或放有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板內(nèi)(預(yù)先用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%的明膠處理，放入37℃，體積分?jǐn)?shù)5%的co2培養(yǎng)箱中孵育6h，去除未粘附細(xì)胞，再放入m199(質(zhì)量濃度50mg/l肝素、質(zhì)量濃度15mg/l ecgs、體積分?jǐn)?shù)20%的胎牛血清完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。co2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，24h后換液1次，以后每2～3d換液1次，直至長(zhǎng)成細(xì)胞單層，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.125%的胰蛋白酶消化備用。細(xì)胞存活率用錐蟲藍(lán)染色判斷。
七、應(yīng)用領(lǐng)域
大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)可用于：（1）血腦屏障的研究；（2）腦血管疾病的病理生理及分子生物學(xué)研究；（3）新藥篩選；（4）腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞生理生化及藥理學(xué)研究。
制備多組大鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞脂多糖損傷模型,通過顯微鏡對(duì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。探討烏司他丁(UTI,Ulinastatin)預(yù)處理對(duì)LPS誘導(dǎo)損傷心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)炎性反應(yīng)的影響。
選取大鼠心肌組織,用PBS液洗除血液,同時(shí)對(duì)大鼠心臟細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),直至長(zhǎng)成細(xì)胞單層,選第3代內(nèi)皮細(xì)胞,0.25%胰蛋白酶消化后將上述細(xì)胞分成6組:(1)空白對(duì)照組:加入無血清培養(yǎng)基;(2)模型組1:加入含0.01μg/mlLPS的無血清培養(yǎng)基作用24h;(3)模型組2:加入含0.1μg/mlLPS的無血清培養(yǎng)基作用24h;(4)模型組3:加入含1μg/mlLPS的無血清培養(yǎng)基作用24h;(5)模型組4:加入含10μg/ml LPS的無血清培養(yǎng)基作用24h;(6)模型組5:加入含100μg/mlLPS的無血清培養(yǎng)基作用24h。
在倒置顯微鏡下、掃描顯微鏡及透射顯微鏡下觀察孵育前和孵育24h后內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變情況。對(duì)于大鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞脂多糖損傷模型進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)干預(yù):1)對(duì)照組不做任何處理;2)阿托法他汀(10000u/ml)預(yù)處理組;3)低濃度(5000u/ml)烏司他丁預(yù)處理組;4)中濃度(10000u/ml)烏司他丁預(yù)處理組;5)高濃度(20000u/ml)烏司他丁預(yù)處理組。
通過免疫組化以及Western blot等檢測(cè)方法對(duì)處理前后各組細(xì)胞進(jìn)行炎性因子檢測(cè),具體指標(biāo)包括白細(xì)胞介素(IL-1)、IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Atg5,Beclinl和LC等在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況;后期進(jìn)行數(shù)據(jù)總結(jié)和分析;通過Western blot法檢測(cè)各組內(nèi)皮細(xì)胞中Bcl-2、bax蛋白表達(dá)水平的變化;MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞活力;流式技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。
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