一、背景
小鼠結腸平滑肌細胞分離自結腸組織；結腸在右髂窩內(nèi)續(xù)于盲腸，在第3骶椎平面連接直腸。結腸分升結腸、橫結腸、降結腸和乙狀結腸4部分，大部分固定于腹后壁，結腸的排列酷似英文字母“M”，將小腸包圍在內(nèi)。結腸橫切面由內(nèi)到外依次為：黏膜(上皮層、固有層、黏膜肌層)，黏膜下層(疏松結締組織)，肌層(內(nèi)環(huán)形、外縱行兩層平滑肌)，外膜(纖維膜或漿膜)。結腸平滑肌細胞主要分布于黏膜肌層和肌層的內(nèi)環(huán)形、外縱行平滑??；結腸運動少而緩慢，對刺激的反應也較遲緩。結腸平滑肌在食物消化與吸收、腸道運動和物質(zhì)分泌、誘發(fā)全身炎癥反應以及細胞內(nèi)信號轉導途徑等研究中起著重要的作用。
結腸平滑肌細胞原代分離培養(yǎng)3天后，可見細胞貼壁伸展，細胞形態(tài)大小不一，呈梭形、不規(guī)則形、三角形或扇形，核卵圓形、居中；2周后細胞匯合，多數(shù)細胞伸展呈長梭形，胞漿豐富，有分枝狀突起，細胞平行排列成單層或部分區(qū)域多層重疊生長，高低起伏；細胞密度低時，常交織成網(wǎng)狀；密度高時，則排列為旋渦狀或柵欄狀。傳代后細胞生長較快，4-6天即可匯合，并保持上述形態(tài)學特征和生長特點。
結腸平滑肌運動活性受到神經(jīng)遞質(zhì)、胃腸激素和藥物等因素的調(diào)節(jié)。隨著現(xiàn)代胃腸動力學研究的進展，對胃腸運動的研究已從器官、組織水平發(fā)展到細胞、分子水平，要求在胃腸道單個平滑肌細胞標本上來完成各種電生理、藥理和分子生物學等實驗。體外培養(yǎng)細胞，由于影響因素單一，是研究細胞功能以及相應的細胞信號轉導機制的基礎。
二、小鼠結腸平滑肌細胞培養(yǎng)操作
1）復蘇小鼠結腸平滑肌細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或將細胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。
2）小鼠結腸平滑肌細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3.按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.將細胞懸液按1：2比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）小鼠結腸平滑肌細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。
下面T25瓶為類；
1、細胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，細胞變圓脫落后，加入1ml含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計數(shù)板計數(shù)。
2、4 min 1000rpm離心去掉上清。加1ml血清重懸細胞，根據(jù)細胞數(shù)量加入血清和DMSO，輕輕混勻，DMSO終濃度為10%，細胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存1ml細胞懸液，注意凍存管做好標識。
3.、將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，2個小時以后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應用
小鼠結腸平滑肌細胞可以用于腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對小鼠結腸平滑肌細胞的重構作用：
通過引入BDNF基因敲除(BDNF+/-)小鼠,觀察BDNF+/-小鼠結腸SMC超微結構的改變及結腸組織平滑肌α-肌動蛋白(smooth muscle a-actin,α-SMA)表達水平的變化,并應用BDNF和TrkB受體阻滯劑(K252a)體外干預C57bl/6小鼠結腸SMC,檢測SMC形態(tài)及α-SMA、相關信號通路蛋白、細胞內(nèi)鈣離子濃度的變化,研究BDNF是否可以直接引起小鼠結腸平滑肌細胞的重構,進而影響腸道動力。
方法：
1、實驗選用健康野生型C57B1/6(BDNF+/+)小鼠和BDNF基因敲除(BDNF+/-)小鼠：電鏡檢測BDNF+/+小鼠和BDNF+/-小鼠結腸平滑肌細胞超微結構的差異；利用Western blotting方法檢測BDNF+/-小鼠和BDNF+/+小鼠α-SMA表達水平的差異。
2、培養(yǎng)原代小鼠結腸平滑肌細胞：細胞免疫熒光鑒定原代結腸SMC是否有TrkB受體的表達；BDNF及K252a分別干預結腸平滑肌細胞,根據(jù)干預不同,分為三組①對照組②BDNF組K252a組,三組細胞均于干預24小時后進行后續(xù)實驗；細胞免疫熒光檢測BDNF及K252a干預后結腸平滑肌細胞形態(tài)的改變；Western blotting檢測干預后SMC中α-SMA,TrkB-PLC-Ca2+信號通路蛋白表達量的變化；鈣離子成像檢測BDNF和K252a干預下SMC中細胞內(nèi)鈣離子濃度的瞬時改變。
3、統(tǒng)計學處理：采用SPSS 17.0軟件,計量資料以x±s表示。BDNF+/-小鼠和BDNF+/+小鼠結腸組織α-SMA表達水平、干預前后細胞內(nèi)鈣離子相對熒光強度值的比較采用獨立樣本t檢驗；BDNF和K252a干預SMC,對照組、BDNF組及BDNF+K252a組細胞核大小、細胞密度、α-SMA表達水平、TrkB信號通路蛋白表達水平總體采用單因素方差分析,若總體差異有統(tǒng)計學意義,以Bonferroni法進行組間兩兩比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
結果：
1、與BDNF+/+小鼠相比,BDNF+/-小鼠結腸平滑肌細胞細胞間隙增寬,充填了大量的膠原纖維；平滑肌細胞的邊界呈多個球狀突起；胞體內(nèi)肌絲的密度減少；
2、與BDNF+/+小鼠相比,BDNF+/-小鼠結腸α-SMA表達水平明顯降低；
3、小鼠原代結腸SMC表達TrkB受體；
4、在BDNF作用下,免疫熒光結果顯示SMC細胞核體積增大,細胞密度增加,骨架蛋白熒光強度增強,BDNF+K252a干預組細胞的形態(tài)改變相反；
5、BDNF組SMC中α-SMA蛋白表達水平明顯高于對照組和BDNF+K252a組;
6、BDNF組結腸平滑肌細胞中TrkB-PLC-Ca2+信號通路蛋白表達水平明顯升高,且在BDNF干預下SMC內(nèi)鈣離子濃度明顯升高,K252a可阻斷以上變化。
結論：
1、BDNF+/-小鼠與BDNF+/+小鼠相比,結腸平滑肌細胞的超微結構和功能均發(fā)生了改變。
2、小鼠原代結腸平滑肌細胞表達TrkB受體,且BDNF干預SMC后,小鼠結腸SMC的形態(tài)和功能均發(fā)生了改變,K252a可以阻斷以上變化。
3、BDNF可能通過TrkB-PLC-Ca2+信號通路引起小鼠結腸平滑肌細胞的重構,進而影響腸道動力。
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