一、背景
SP20-AG14小鼠骨髓瘤貼壁細(xì)胞系是由綿羊紅細(xì)胞免疫的BA LB/c小鼠脾細(xì)胞和P3X 63A g8骨髓瘤細(xì)胞融合得到的。Sp2/0-A g14細(xì)胞不分泌免疫球蛋白，對(duì)20μg/ml的8-氮鳥嘌呤有抗性，對(duì)H A T比較敏感；Sp2/0-A g14細(xì)胞可以作為細(xì)胞融合時(shí)的B細(xì)胞組分用于制備雜交瘤；鼠痘病毒陰性。
二、細(xì)胞培養(yǎng)操作步驟
1、SP20-AG14小鼠骨髓瘤貼壁細(xì)胞系培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：
1）準(zhǔn)備DMEM（推薦iCell-0001）培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。
2）注意：圓形，懸浮生長，不要用力吹打(生長時(shí)會(huì)沉到瓶底）
3）SP20-AG14小鼠骨髓瘤貼壁細(xì)胞系培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
4）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。
2、SP20-AG14小鼠骨髓瘤貼壁細(xì)胞系細(xì)胞處理：
1）凍存細(xì)胞的復(fù)蘇：
將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況和細(xì)胞密度。
2）SP20-AG14小鼠骨髓瘤貼壁細(xì)胞系細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)70%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
該細(xì)胞輕微貼壁和懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，傳代可以參考以下方法：
1.收集：將培養(yǎng)瓶中的懸浮的細(xì)胞收集到離心管中。用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。由于細(xì)胞貼壁不牢PBS潤洗后細(xì)胞會(huì)脫落所以PBS也要回收到離心管中。
2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL）置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長消化時(shí)間），然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。
3.將收集到的懸浮細(xì)胞、pbs清洗液中的細(xì)胞和消化下來的貼壁細(xì)胞以1000rpml離心5min，棄去上清，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后重懸混勻后將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長活力，后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行。
3）SP20-AG14小鼠骨髓瘤貼壁細(xì)胞系細(xì)胞凍存:收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時(shí)凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。
三、應(yīng)用
SP20-AG14小鼠骨髓瘤貼壁細(xì)胞系可以用于鴨圓環(huán)病毒Cap蛋白單克隆抗體及免疫膠體金試紙條的研制：
以Cap蛋白為研究對(duì)象,制備單克隆抗體,研發(fā)快速檢測(cè)DuCV的膠體金免疫試紙條,實(shí)現(xiàn)DuCV的快速診斷與防治。
本研究中去除DuCV Cap的N端核定位序列(Nuclear localization signals,NLS),即去除Cap基因的5′端1-108 bp區(qū)域,保留剩余的109-774 bp區(qū)域,N端引入His標(biāo)簽,以便于抗原的純化,最后將核酸序列克隆到大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒p ET-28a中,質(zhì)粒命名為p ET-28a-Cap,并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21菌株中使Cap蛋白能夠高效的表達(dá)。
最終得以確定其最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為在終濃度0.1 m M IPTG誘導(dǎo)劑中37℃誘導(dǎo)3 h,重組Cap蛋白主要以包涵體形式得到表達(dá)。使用弗氏佐劑制備的重組DuCV Cap蛋白免疫2只Balb/c雌性小鼠,ELISA檢測(cè)2只小鼠的血清抗體效價(jià)均在1:20480,滿足細(xì)胞融合的要求,分離提取免疫小鼠脾臟細(xì)胞和sp2/0細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合,ELISA方法篩選能夠分泌抗DuCV Cap蛋白的特異性抗體的陽性孔并進(jìn)行亞克隆,最終獲得了能夠穩(wěn)定分泌抗DuCV Cap蛋白的一株雜交瘤細(xì)胞株6A1。
Western bolt結(jié)果顯示,6A1株單克隆抗體可以和重組DuCV Cap蛋白以及天然DuCV Cap蛋白能發(fā)生特異性的結(jié)合。對(duì)單抗6A1的Ig G類型鑒定結(jié)果表明6A1的Ig G類型為Ig G1亞類和Kappa輕鏈。將6A1雜交瘤細(xì)胞株注射到雌性Balb/c小鼠的腹腔用以大量制備單克隆抗體,間接ELISA檢測(cè)結(jié)果表明注射雜交瘤細(xì)胞株小鼠腹水的抗體效價(jià)可達(dá)1:102400。
同時(shí),用弗氏佐劑制備的重組DuCV Cap蛋白疫苗對(duì)2只健康新西蘭兔進(jìn)行免疫,制備抗DuCV Cap蛋白多克隆抗體,經(jīng)3次免疫7天后使用間接ELISA方法檢測(cè)兔血清的抗體效價(jià),結(jié)果顯示兩只兔血清的抗體效價(jià)均達(dá)到了1:163840,經(jīng)Western blot鑒定,該兔多抗對(duì)重組DuCV Cap蛋白以及天然DuCV Cap蛋白均能發(fā)生特異性的結(jié)合。
經(jīng)過Protein A+G對(duì)小鼠腹水和兔血清進(jìn)行抗體純化,獲得了高純度的鼠抗DuCV Cap蛋白的單克隆抗體和兔抗多克隆抗體。進(jìn)而以純化的兔抗DuCV Cap蛋白多克隆抗體作為T線(2 mg/m L),純化的鼠6A1單克隆抗體(64μg/m L,p H 8.0)作為膠體金標(biāo)記抗體,以羊抗鼠Ig G(1 mg/m L)作為C線,組裝膠體金檢測(cè)試紙條。該DuCV抗原膠體金免疫層析試紙條在檢測(cè)MDPV、GPV、DPV、NDV、AIV、DHV、FAd V和DRV中均不發(fā)生交叉反應(yīng),試紙條特異性良好,檢測(cè)抗原的敏感度可達(dá)15.6μg/m L。
在39份的疑似感染鴨樣品的檢測(cè)中,分別用本次研究制備的膠體金試紙條與傳統(tǒng)的PCR兩種方法進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果符合率可達(dá)94.9%,檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度較高,同時(shí)經(jīng)多次測(cè)試都表明試紙條有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性,能夠在10 min內(nèi)完成對(duì)樣品的快速檢測(cè)。
總之,本次研究制備的基于DuCV Cap蛋白單克隆抗體的膠體金抗原檢測(cè)試紙條可以實(shí)現(xiàn)快速、特異地檢測(cè)臨床樣本中的DuCV,可用于DuCV的基層診斷和篩查工作。
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