一、背景
人食管鱗癌細(xì)胞從一位49歲，已經(jīng)接受過(guò)放療的日本女性患者的頸部食管中分離建立的低分化食管鱗癌。癌組織已侵襲至相鄰組織。文獻(xiàn)報(bào)道細(xì)胞攜帶有增多的癌基因C-ERB-B(8倍)和CYCLIN D1(4倍)并且細(xì)胞在裸鼠中能夠成瘤。
人食管鱗癌細(xì)胞系集落不規(guī)則沒(méi)有顯著角質(zhì)化的侵染性鱗狀細(xì)胞癌。單層培養(yǎng)的細(xì)胞間可以觀察到帶狀連接，也注意到有細(xì)胞質(zhì)張力絲。1970年發(fā)現(xiàn)支原體污染并去除。腫瘤壞死因子（TNF）α抑制ME-180的生長(zhǎng)。這株細(xì)胞含有人乳頭瘤病毒（HPV）DNA，與HPV-39的同源性高于HPV-18。
二、人食管鱗癌細(xì)胞培養(yǎng)操作
1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.將細(xì)胞懸液按1：2比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
下面T25瓶為類；
1.細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入1ml含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
2.4 min 1000rpm離心去掉上清。加1ml血清重懸細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入血清和DMSO，輕輕混勻，DMSO終濃度為10%，細(xì)胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存1ml細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。
3.將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，2個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應(yīng)用
人食管鱗癌細(xì)胞可以用于ZNF382抑制人食管鱗癌細(xì)胞生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移的功能與機(jī)制研究：
研究ZNF382在人食管鱗癌中的表觀遺傳學(xué)調(diào)控及抑制人食管鱗癌細(xì)胞生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移的功能與分子機(jī)制研究。
方法和結(jié)果：實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)15對(duì)人食管鱗癌組織和癌旁組織中ZNF382的差異性表達(dá),結(jié)果顯示ZNF382在人食管鱗癌組織中的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織(p<0.05)。
MSP分別檢測(cè)ZNF382在114例人食管鱗癌組織與3例正常食管上皮組織中的甲基化狀態(tài),發(fā)現(xiàn)87%的食管鱗癌組織發(fā)生了啟動(dòng)子區(qū)的甲基化,而在正常食管上皮組織中甲基化發(fā)生率只有33%。同時(shí)TCGA在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析183例食管鱗癌患者ZNF382表達(dá)水平差異與食管鱗癌患者5年總生存的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)ZNF382表達(dá)水平較高的患者,其5年總生存期較長(zhǎng)。
進(jìn)而通過(guò)一系列生物學(xué)功能實(shí)驗(yàn)分別在食管鱗癌細(xì)胞中外源性過(guò)表達(dá)ZNF382及敲低內(nèi)源性ZNF382表達(dá)后,觀察其對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖,凋亡以及轉(zhuǎn)移的作用。最后為進(jìn)一步明確ZNF382在食管鱗癌中發(fā)揮細(xì)胞功能的具體分子機(jī)制,送檢了RNA-sequence測(cè)序并結(jié)合GEO數(shù)據(jù)庫(kù)的CHIP-Seq測(cè)序結(jié)果,聯(lián)合生物信息學(xué)分析,RT-PCR驗(yàn)證,Western blot及雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論,ZNF382作為19q13.12的新抑癌基因通過(guò)直接結(jié)合到DVL2和FZD1基因的啟動(dòng)子區(qū)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性從而在人食管鱗癌細(xì)胞中發(fā)揮抑癌功能。
結(jié)論：ZNF382是位于19q13.12的新抑癌基因,直接結(jié)合到FZD1和DVL2基因的啟動(dòng)子區(qū)抑制Wnt/β-catenin通路活性從而在人食管鱗癌細(xì)胞中發(fā)揮抑癌作用。
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