一、背景
人胰腺癌細胞來自一個胰腺癌病人的腹水中的細胞移植到裸鼠后建立了這個細胞株。在本庫通過支原體檢測。人胰腺癌細胞通過STR檢測。可以表達CEA，人胰腺相關(guān)抗原、人胰腺特異性抗原和黏蛋白。
二、人胰腺癌細胞培養(yǎng)操作
1）復(fù)蘇人胰腺癌細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?0cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。
2）人胰腺癌細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3.按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.將細胞懸液按1：2比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。
下面T25瓶為類；
1.人胰腺癌細胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，細胞變圓脫落后，加入1ml含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計數(shù)板計數(shù)。
2.4 min 1000rpm離心去掉上清。加1ml血清重懸細胞，根據(jù)細胞數(shù)量加入血清和DMSO，輕輕混勻，DMSO終濃度為10%，細胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存1ml細胞懸液，注意凍存管做好標識。
3.將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，2個小時以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應(yīng)用
人胰腺癌細胞可以用于SPINK1慢病毒過表達載體和其穩(wěn)轉(zhuǎn)AsPC-1細胞株的構(gòu)建及其對人胰腺癌細胞增殖的影響：
制作包含人SPINK1基因的完整編碼區(qū)序列的慢病毒過表達載體,用此載體感染人胰腺癌AsPC-1細胞,并建立SPINK1過表達的穩(wěn)轉(zhuǎn)AsPC-1細胞株,以此來探索此基因在胰腺癌細胞中是否具有促進腫瘤細胞增殖和克隆形成的能力,并為今后進一步的研究奠定基礎(chǔ)。
方法：首先構(gòu)建SPINK1慢病毒過表達載體,包裝病毒并產(chǎn)生病毒顆粒。應(yīng)用PCR方法擴增SPINK1基因的全部編碼序列,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后切膠回收DNA,將其與慢病毒載體(pLenti-CMV-2A-GFP)同時用限制性內(nèi)切酶酶切后,用T4 DNA連接酶進行連接,將構(gòu)建好的人SPINK1慢病毒過表達載體(pLenti-CMV-hSPINK1-2A-GFP)進行轉(zhuǎn)化,提取DNA進行酶切后,通過瓊脂糖凝膠電泳和基因測序進行鑒定。
用已鑒定正確的SPINK1慢病毒過表達載體和慢病毒包裝混合質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞產(chǎn)生病毒顆粒,過濾并高速離心濃縮病毒顆粒。然后用此病毒顆粒感染并建立SPINK1過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)AsPC-1細胞株,使用嘌呤霉素(2ug/ml)藥物篩選病毒感染后的陽性克隆并擴增,培養(yǎng)成SPINK1過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)AsPC-1細胞株。
通過實時熒光定量PCR(Real-time PCR)和Western Blot的方法檢測病毒感染后SPINK1基因在mRNA水平與蛋白水平上的表達變化。
最后用CCK-8法、臺盼藍染色法、流式細胞儀檢測SPINK1基因?qū)θ艘认侔〢sPC-1細胞增殖能力的影響,并通過平板細胞克隆形成實驗來檢測SPINK1基因?qū)θ艘认侔〢sPC-1細胞克隆形成能力的影響。
結(jié)果：經(jīng)酶切、瓊脂糖凝膠電泳實驗和基因測序鑒定,證實SPINK1慢病毒過表達載體(pLenti-CMV-h SPINK1-2A-GFP)構(gòu)建正確。SPINK1慢病毒過表達載體和慢病毒包裝混合質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞后,在熒光顯微鏡下可觀察到許多綠色熒光點,并伴有漂浮細胞和破裂細胞,感染效率可達90%。
用慢病毒顆粒感染AsPC-1細胞,經(jīng)嘌呤霉素藥物篩選出陽性克隆,將陽性克隆連續(xù)培養(yǎng)擴增數(shù)代后經(jīng)Real-time PCR和Western Blot的方法檢測,SPINK1基因可在AsPC-1細胞中穩(wěn)定高效地表達,與陰性對照相比病毒感染后的SPINK1基因在mRNA水平與蛋白水平上的表達量分別上調(diào)了25倍和5倍。
在CCK-8實驗中,SPINK1過表達AsPC-1細胞的光密度值為1.4 OD,對照組細胞的光密度值為1.0 OD,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001);臺盼藍染色檢測細胞活性的實驗發(fā)現(xiàn),SPINK1過表達AsPC-1細胞的活性為(93.30±0.40)%,對照組細胞活性為(71.97±0.78)%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001);
流式細胞儀檢測細胞周期的實驗中,SPINK1過表達AsPC-1細胞處于DNA合成期(S期)和DNA合成后期/分裂期(G2/M期)的DNA百分比為38.89%,與其對照的親本AsPC-1細胞百分比為22.02%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001);平板細胞克隆形成實驗發(fā)現(xiàn)SPINK1基因上調(diào)的AsPC-1細胞克隆形成率為(9.70±0.66)%,對照的親本細胞克隆形成率為(1.23±0.31)%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。
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