一、背景
KG-1A人急性骨髓白血病細(xì)胞系是一種人類急性髓系白血病的細(xì)胞系，來源于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所。該細(xì)胞系具有高度致死性、易產(chǎn)生耐藥性和易發(fā)生突變等特點(diǎn)，因此在臨床治療中應(yīng)用較為有限。
二、KG-1A人急性骨髓白血病細(xì)胞系具有以下特點(diǎn)
1、來源：KG-1A細(xì)胞系是由中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院的研究人員從中國健康人群中分離出來的，因此具有較高的親緣關(guān)系和代表性。
2、分化程度：KG-1A細(xì)胞系的分化程度較低，即原始造血干細(xì)胞水平，這使得它在體外培養(yǎng)時(shí)具有較強(qiáng)的增殖能力和抗凋亡能力。
3、基因組特征：KG-1A細(xì)胞系具有較豐富的基因突變，包括常見的染色體易位、缺失、插入等，這些突變?yōu)檠芯緼ML的分子機(jī)制提供了豐富的資源。
4、臨床應(yīng)用：由于KG-1A細(xì)胞系具有較強(qiáng)的體外生長能力和較好的體內(nèi)移植潛力，因此在AML的基礎(chǔ)研究和臨床治療中具有重要價(jià)值。
三、KG-1A人急性骨髓白血病細(xì)胞系培養(yǎng)步驟
1、準(zhǔn)備培養(yǎng)基：使用含有葡萄糖、氨基酸、維生素和礦物質(zhì)的LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基。將培養(yǎng)基加入高壓滅菌器中進(jìn)行滅菌，然后將其放入37°C、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中預(yù)熱至37°C。
2、收集細(xì)胞樣本：從患者體內(nèi)采集骨髓或外周血樣本，并按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程處理樣本。通常采用Ficoll-Paque或Percoll離心法分離出白血病細(xì)胞。
3、洗滌細(xì)胞：用生理鹽水洗滌細(xì)胞兩次，以去除殘留的血液成分和雜質(zhì)。
4、添加抗生素：將0.5μg/ml的gentamicin或kanamycin添加到培養(yǎng)基中，以防止細(xì)菌污染。
5、分瓶培養(yǎng)：將洗滌后的細(xì)胞懸液加入到預(yù)先準(zhǔn)備好的無菌試管中，每個(gè)試管加入約100μl的細(xì)胞懸液。將試管標(biāo)記上患者的姓名和日期，并將它們放置在37°C、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中。
6、細(xì)胞生長與傳代：觀察細(xì)胞的生長情況，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)，需要進(jìn)行傳代。傳代的方法是將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到新的無菌試管中，每瓶加入10-20ml的新鮮培養(yǎng)基，并在37°C、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
四、應(yīng)用
KG-1A人急性骨髓白血病細(xì)胞系可以用于KG1a耐藥細(xì)胞的構(gòu)建及其通過sEVs改變受體細(xì)胞耐藥性的研究：
通過地西他濱梯度誘導(dǎo)構(gòu)建了一株耐受地西他濱的KG1a(急性髓系白血病細(xì)胞),以下簡稱KG1a-DAC。通過檢測(cè)KG1a和KG1a-DAC的IC50,以及地西他濱對(duì)KG1a和KG1a-DAC增殖能力和細(xì)胞活力的影響。
結(jié)果表明成功構(gòu)建了KG1a-DAC(KG1a-DAC比KG1a對(duì)地西他濱的IC50>=10)。接著,本論文以KG1a和KG1a-DAC為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,研究KG1a-DAC是否影響KG1a對(duì)地西他濱的敏感性。
主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
(1)與KG1a-DAC共培養(yǎng)可以降低KG1a對(duì)地西他濱的敏感性。并且發(fā)現(xiàn)KG1a-DAC來源的條件培養(yǎng)基也可以降低KG1a對(duì)地西他濱的敏感性。
(2)用KG1a-DAC來源的sEVs處理KG1a后,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明KG1a-DAC來源的sEVs能顯著降低KG1a對(duì)地西他濱的敏感性。
(3)共培養(yǎng)后的KG1a中地西他濱代謝相關(guān)蛋白ENT1,DCK,CDA蛋白沒有顯著變化,但是抑癌基因P15INK4B顯著降低。用KG1a-DAC來源的sEVs處理KG1a,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明KG1a-DAC來源的sEVs能抑制地西他濱誘導(dǎo)KG1a中P15INK4B表達(dá)。且通過GW4869抑制sEVs的分泌阻礙了KG1a-DAC對(duì)KG1a的影響,進(jìn)一步證明KG1a-DAC主要通過sEVs抑制KG1a中P15INK4B表達(dá),減弱其對(duì)地西他濱的敏感性。
(4)通過miRDB,miRWalk,targetscan數(shù)據(jù)網(wǎng)站預(yù)測(cè),以及RT-qPCR驗(yàn)證鑒定出KG1a-DAC來源的sEVs包含靶向P15INK4B基因的miR-323b-5p。通過向KG1a中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-323b-5p inhibitor后與KG1a-DAC共培養(yǎng),再檢測(cè)KG1a中P15INK4B的表達(dá),實(shí)驗(yàn)證明miR-323b-5P的靶基因是P15INK4B。
(5)向KG1a中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-323b-5p inhibitor后與KG1a-DAC共培養(yǎng),隨后通過CCK8檢測(cè)KG1a的活力,結(jié)果證明miR-323b-5p inhibitor能阻斷共培養(yǎng)影響KG1a對(duì)藥物的敏感性。
綜上發(fā)現(xiàn)KG1a-DAC通過sEVs傳遞miR-323b-5p,從而抑制KG1a中P15INK4B的表達(dá),以此降低KG1a對(duì)地西他濱的敏感性。
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