一、背景
人膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞是一種來源于膀胱的腫瘤細(xì)胞，是膀胱癌的主要類型之一。T24細(xì)胞源自病人的轉(zhuǎn)移性細(xì)胞腺癌，對T24和相關(guān)細(xì)胞株有細(xì)胞毒性。T24細(xì)胞群體倍增時(shí)間為19小時(shí)，含ras(H-ras)癌基因。
二、人膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞培養(yǎng)步驟
1、人膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：
1）準(zhǔn)備RPMI-1640培養(yǎng)基(RPMI-1640:GIBCO,添加NaHCO3 1.5g/L,D-葡萄糖2.5g/L,丙酮酸鈉0.11g/L)，90%；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%。
2）膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞凍存液：90%完全培養(yǎng)基，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲存。
2、細(xì)胞處理：
1）復(fù)蘇人膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）人膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）人膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。貼壁細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后加入少量胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入約1ml含血清的培養(yǎng)基后加入凍存管中，再添加10%DMSO后進(jìn)行凍存。
三、應(yīng)用
人膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞可以用于腺病毒介導(dǎo)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶基因轉(zhuǎn)染對膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞的影響：
研究試圖通過腺病毒介導(dǎo)的方法將外源性iNOS導(dǎo)入膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞T24中,上調(diào)細(xì)胞內(nèi)iNOS基因的表達(dá),促使細(xì)胞釋放大量NO,提高細(xì)胞內(nèi)NO的濃度,從而干擾細(xì)胞的生長周期,誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。以腺病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)在腫瘤基因治療中應(yīng)用較為普遍,目的基因可以整合到病毒基因組而后隨病毒一起感染宿主細(xì)胞。腺病毒具有嗜膀胱細(xì)胞的特性,而膀胱又是一個(gè)半開放器官,這使應(yīng)用腺病毒載體進(jìn)行膀胱癌的基因治療成為可能。基因治療聯(lián)合現(xiàn)有治療方法尋找對抗膀胱癌復(fù)發(fā)的新思路和新途徑已成為研究熱點(diǎn)。
采用聯(lián)合小劑量化療藥物(HCPT、THP)對人膀胱移行細(xì)胞癌T24細(xì)胞進(jìn)行體外殺傷,并進(jìn)行比較,為腺病毒介導(dǎo)的iNOS的基因療法聯(lián)合化療藥物治療膀胱癌提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本課題由三部分組成。
目的：利用腺病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建攜帶iNOS基因的重組腺病毒載體,并獲得rAd-iNOS重組腺病毒,用于后續(xù)對T24細(xì)胞作用的研究。本實(shí)驗(yàn)在先前工作的基礎(chǔ)上,將iNOS基因開放閱讀框(open reading frame,ORF)片段先亞克隆至腺病毒穿梭載體pYr-adshuttle-1,然后體外重組至腺病毒載體pAd/BL-DEST,構(gòu)建重組腺病毒載體,并轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞進(jìn)行腺病毒包裝,從而獲得重組腺病毒rAd-iNOS。
方法：為確保模板質(zhì)粒pReceive-M29-iNOS的正確性,將模板質(zhì)粒進(jìn)行序列測定。測序正確后,雙酶切pReceive-M29-iNOS及腺病毒穿梭載體pYr-adshuttle-1,瓊脂糖凝膠電泳檢測后分別回收iNOS片段的帶和線狀pYr-adshuttle-1載體帶,連接,轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α,搖菌擴(kuò)增,提取重組質(zhì)粒pYr-adshuttle-1-iNOS,進(jìn)行酶切鑒定和DNA測序。將鑒定正確的重組質(zhì)粒采用LR體外同源重組將iNOS表達(dá)框亞克隆至腺病毒表達(dá)載體pAd/BL-DEST,PacI酶切重組腺病毒載體pAd-iNOS,使重組腺病毒載體線性化后轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞HEK 293,包裝成重組腺病毒rAd-iNOS,PCR鑒定并測定病毒滴度。
結(jié)果：經(jīng)測序,模板質(zhì)粒pReceive-M29-iNOS的DNA序列分析結(jié)果與預(yù)期結(jié)果完全相符,與NCBI公布的iNOS的ORF進(jìn)行序列比對,正確性高達(dá)100%；經(jīng)酶切分析、測序結(jié)果表明腺病毒穿梭載體pYr-adshuttle-1-iNOS和腺病毒載體pAd-iNOS構(gòu)建成功；經(jīng)PCR鑒定,重組腺病毒rAd-iNOS包裝成功,其滴度達(dá)5.8×108PFU/ml。
結(jié)論：成功構(gòu)建了重組腺病毒穿梭載體pYr-adshuttle-1-iNOS和重組腺病毒載體pAd-iNOS后,采用HEK293細(xì)胞進(jìn)行腺病毒包裝,最終獲得重組腺病毒rAd-iNOS。
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