一、背景
弓形桿菌屬通用PCR試劑盒采用SYBR Green染料法實時熒光PCR技術，針對弓形桿菌屬的基因高度保守區(qū)域設計特異性引物，用熒光PCR技術對弓形桿菌屬的核酸進行體外擴增檢測，在反應體系中含弓形桿菌屬核酸模板的情況下，PCR反應得以進行并釋放熒光信號，利用儀器對PCR過程中相應通道的信號強度進行實時監(jiān)測和輸出，實現(xiàn)檢測結果的定性、定量分析。
二、弓形桿菌屬通用PCR試劑盒產(chǎn)品及特點
實時熒光定量PCR技術（Arcobacter spp.PCR，qPCR）是指在PCR反應體系中加入可與DNA產(chǎn)物特異性結合的熒光基團(包括熒光染料或熒光標記的特異性探針)，對PCR產(chǎn)物進行標記跟蹤，隨著PCR反應的進行，反應產(chǎn)物不斷累積，熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一次熒光強度信號，這樣即可通過熒光信號強度的變化實時監(jiān)測整個PCR過程中產(chǎn)物量的變化，并結合相應軟件對產(chǎn)物進行分析，可以得到熒光擴增曲線，從而計算待測樣品中目的基因初始模版的量，常用于分析目的基因的表達水平的變化。它具有下列特點：
1、即開即用，用戶只需要提供病毒樣品。
2、根據(jù)弓形桿菌屬通用保守序列設計的專一性引物，與相關病毒無交叉反應。
3、靈敏度可以達到幾百拷貝/反應。
4、一管式熒光定量PCR檢測，避免后續(xù)污染。
5、弓形桿菌屬通用PCR試劑盒足夠50次20μL反應體系的熒光定量PCR。
三、應用
弓形桿菌屬通用PCR試劑盒可以用于文蛤體內(nèi)細菌的分離鑒定和群落結構分析：
通過純培養(yǎng)方式對文蛤鰓組織內(nèi)共生細菌進行了分離、篩選與鑒定,在此基礎上對內(nèi)共生細菌的種類和數(shù)量進行了統(tǒng)計和分析。
通過16S r RNA擴增子測序方法,對處于不同健康狀態(tài)的文蛤鰓及肝胰腺組織的細菌群落結構組成進行了分析,發(fā)現(xiàn)文蛤的細菌種群豐度在不同的健康狀態(tài)下及不同的組織中均有變化,同時發(fā)現(xiàn)了不同健康狀態(tài)下文蛤肝胰腺組織中具有顯著性差異的細菌類群。
此外,利用前期篩選到的潛在致病菌弓形桿菌MP43對文蛤進行了攻毒實驗,評估了對文蛤可能的致病能力及其對免疫的影響。
主要結果如下：
1、通過采用純培養(yǎng)方式,對文蛤鰓組織內(nèi)共生細菌進行了多批次的分離與篩選。對得到的純培養(yǎng)細菌進行了16S r RNA基因序列測序及比對分析,共得到了變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria)等6個綱、13個目、23個科、47個屬的215株細菌。分離細菌較多的屬級類群有交替單胞菌屬(Alternomonas)、Nautella屬、葡萄球菌屬(Staphylococcus)和假單胞菌屬(Pseudomonas),分別分離到20株、18株、15株以及13株細菌。該研究統(tǒng)計了純培養(yǎng)方式鑒定得到的文蛤鰓組織中內(nèi)共生微生物的種類及數(shù)量,為后續(xù)對文蛤內(nèi)共生菌群的深入探究提供了參考。
2、采用16S rRNA擴增子測序,對處于不同健康狀態(tài)的文蛤鰓及肝胰腺組織的細菌群落結構進行了分析。對得到的OTU數(shù)據(jù)進行聚類分析和物種注釋,結果顯示文蛤體內(nèi)的細菌組成在不同的健康狀態(tài)以及不同的組織中均有差異。健康狀態(tài)的文蛤鰓及肝胰腺組織中,變形菌門均為豐度最高的類群,肝胰腺中放線菌門、厚壁菌門和擬桿菌門的豐度明顯高于鰓組織;在屬級單元,文蛤鰓組織中細菌豐度最高的類群為弓形桿菌屬(Arcobacter),而肝胰腺中豐度最高的屬級類群為紅球菌屬(Rhodococcus)。發(fā)病狀態(tài)的文蛤鰓組織中的細菌種類在門級單元上遠少于肝胰腺組織,在屬級單元上鰓組織中Endozoicomonas屬占據(jù)著極高的豐度,而肝胰腺中豐度最高的類群為不動桿菌屬(Acinetobacter)。對兩種不同健康狀態(tài)下的文蛤進行比較,肝胰腺中細菌組成的Alpha多樣性和Beta多樣性均無顯著性差異,但進一步分析發(fā)現(xiàn)兩組樣品中有4個具有顯著性差異的細菌類群,可作為文蛤健康狀態(tài)指示的微生物參考指標。
3、不同溫度條件下利用不同濃度的MP43對文蛤的人工感染實驗結果表明,致死率與對照組之間均無顯著差異,顯示該菌株對文蛤不具有直接致病性;通過對攻毒后文蛤肝胰腺組織進行免疫相關基因的表達分析,顯示文蛤的免疫系統(tǒng)對于MP43菌株未產(chǎn)生明顯響應,肝胰腺弧菌載菌量也未呈現(xiàn)顯著變化。
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