一、背景
TCCSUP人膀胱移行細胞癌貼壁細胞系于1974年從一個未分化的移行細胞癌建系，該患者在切除腫瘤之前有4個月的血尿病史。后來發(fā)現(xiàn)了向骨髓的轉移。超微結構研究表明存在微絨毛和脂質體，但未觀察到橋粒。
二、TCCSUP人膀胱移行細胞癌貼壁細胞系培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備
1）準備MEM（推薦YJ-0012）培養(yǎng)基；優(yōu)質胎牛血清，10%；雙抗，1%。
2）TCCSUP人膀胱移行細胞癌貼壁細胞系培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）TCCSUP人膀胱移行細胞癌貼壁細胞系凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。
三、TCCSUP人膀胱移行細胞癌貼壁細胞系細胞處理
1）凍存細胞的復蘇：
將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完全培養(yǎng)基重懸細胞。然后將細胞懸液加入含6-8ml完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況和細胞密度。
2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
對于貼壁細胞傳代可以參考以下方法：
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細胞可以適當延長消化時間），然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。
3.輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細胞的生長活力，后續(xù)傳代根據(jù)實際情況按1:2~1:5的比例進行。
3）TCCSUP人膀胱移行細胞癌貼壁細胞系細胞凍存:收到細胞后建議在培養(yǎng)前3代時凍存一批細胞種子以備后續(xù)實驗使用。
四、應用
TCCSUP人膀胱移行細胞癌貼壁細胞系可以用于順鉑相關cGAS-STING信號激活對膀胱癌增殖的影響及其機制研究：
探討膀胱癌順鉑治療免疫效應,有助于深入理解順鉑的綜合作用機制。
研究目的：
1、探討順鉑相關免疫效應與膀胱癌內(nèi)源性c GAS-STING通路激活的相關性及其調控機制；
2、探索順鉑誘導的膀胱癌內(nèi)源性c GAS-STING信號激活對膀胱癌增殖的影響及其機制；
研究方法：
1、首先通過RNA轉錄組測序聯(lián)合生物信息學分析發(fā)現(xiàn),順鉑處理激活了T24膀胱癌細胞系中多種免疫炎癥相關通路,且這些免疫炎癥通路的激活可能與c GAS-STING信號的激活相關。結合公共數(shù)據(jù)庫我們探索了STING蛋白在膀胱癌中的基礎表達水平。通過實時熒光定量PCR,蛋白印跡實驗,酶聯(lián)免疫吸附實驗,報告基因實驗,免疫熒光以及流式細胞分析技術等來驗證了順鉑處理后膀胱癌細胞系中c GAS-STING通路及其下游信號是否激活。通過小干擾沉默STING或使用STING特異抑制劑H151來驗證T24、TCCSUP膀胱癌細胞系順鉑相關的免疫效應是否顯著減弱。
2、結合公共數(shù)據(jù)庫探索膀胱癌中STING激活上游蛋白c GAS的基礎表達水平。通過免疫熒光,亞細胞組分蛋白印跡試驗探索順鉑處理后膀胱癌細胞系的DNA損傷修復狀態(tài);探索順鉑處理后膀胱癌細胞系中c GAS的總體表達水平,細胞定位以及染色質綁定c GAS蛋白水平是否改變。
3、使用CCK-8試驗以及克隆形成試驗探索STING蛋白敲低后膀胱癌細胞系的體外增殖水平是否改變。結合TCGA數(shù)據(jù)庫分析c GAS-STING中關鍵蛋白的中位數(shù)表達水平是否與患者的整體生存以及無病生存相關。
4、使用慢病毒轉染構建STING-Knockdown及STING-WT穩(wěn)轉MB49小鼠來源膀胱癌細胞株。在C57BL/6J小鼠中構建MB49膀胱癌皮下移植模型,比較PBS聯(lián)合STING-Knockdown組,PBS聯(lián)合STING-WT組,順鉑聯(lián)合STING-Knockdown組,順鉑聯(lián)合STING-WT組小鼠皮下瘤增殖情況,并通過流式細胞技術分析CD3+CD45+,CD8+CD45+,CD11c+MHCII+以及F4/80+CD11b+免疫細胞浸潤比例。結合上述結果分析順鉑相關STING信號激活對小鼠膀胱癌皮下移植瘤增殖的影響及其可能機制。
最后使用CIBERSORT分析TCGA數(shù)據(jù)庫中接受過膀胱癌順鉑化療患者的預后與腫瘤微環(huán)境免疫細胞浸潤水平的相關性。
研究結果：
1、順鉑誘導膀胱癌細胞產(chǎn)生免疫效應,主要體現(xiàn)為I型干擾素分泌等免疫通路的富集以及包括IL-6,INF-β等細胞因子、趨化因子分泌顯著增加,這種免疫效應和c GAS-STING通路的激活密切相關。順鉑誘導的T24、TCCSUP膀胱癌細胞系中ds DNA累積以及染色質綁定c GAS蛋白的釋放可能是激活c GAS-STING信號并導致下游特殊免疫效應的重要原因。
2、沉默或抑制STING不影響T24、TCCSUP膀胱癌細胞系體外增殖水平。在C57BL/6J小鼠皮下移植瘤實驗中,順鉑激活的膀胱癌細胞內(nèi)源性c GAS-STING信號抑制了的小鼠膀胱癌皮下瘤的增殖。同時膀胱癌內(nèi)源性c GAS-STING信號的激活誘導了小鼠膀胱癌皮下瘤免疫微環(huán)境浸潤性CD11c+MHCII+和CD8+CD45+細胞增加。
研究結論：順鉑可通過誘導DNA損傷以及促進染色質綁定c GAS蛋白釋放等方式激活膀胱癌內(nèi)源性c GAS-STING信號。順鉑誘導的膀胱癌內(nèi)源性c GAS-STING信號的激活促進了包括IL-6,INF-β在內(nèi)的細胞因子分泌,并誘導了小鼠膀胱癌皮下瘤腫瘤微環(huán)境中浸潤性CD11c+MHCII+和CD8+CD45+細胞增加。這些結果將為晚期膀胱癌治療中順鉑聯(lián)合免疫療法的嘗試提供新的思路。
北京百歐博偉生物技術有限公司的微生物菌種查詢網(wǎng)提供微生物菌種保藏、測序、購買等服務,是中國微生物菌種保藏中心的服務平臺，并且是集微生物菌種、菌種,ATCC菌種、細胞、培養(yǎng)基為一體的大型微生物查詢類網(wǎng)站，自設設備及技術的微生物菌種保藏中心！歡迎廣大客戶來詢！