一、背景
MIA PaCa-2人胰腺導(dǎo)管癌貼壁細(xì)胞系是由A.Yunis等人于1975年從一名65歲的高加索男性獲得的胰腺腫瘤組織中建立的。據(jù)報(bào)道，該細(xì)胞系倍增時(shí)間約40小時(shí)，在軟瓊脂中的集落形成效率約19％。該細(xì)胞系對(duì)天冬酰胺酶敏感。
二、MIA PaCa-2人胰腺導(dǎo)管癌貼壁細(xì)胞系培養(yǎng)步驟
（一）MIA PaCa-2人胰腺導(dǎo)管癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞復(fù)蘇：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加4-6mL完全培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6cm皿中），培養(yǎng)過(guò)夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
（二）MIA PaCa-2人胰腺導(dǎo)管癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
a）對(duì)于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：
1、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
2、加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的完全培養(yǎng)基終止消化。
3、輕輕吹打細(xì)胞，完全脫落后吸出，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4、按5-6ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)液，將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新的含5-6 ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中。
（三）MIA PaCa-2人胰腺導(dǎo)管癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞凍存：
1、細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時(shí)，棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞一次；
2、添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后加入完全培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打細(xì)胞使之脫落，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1000rpm離心5min；
3、用適量的凍存液重懸細(xì)胞，并放置于凍存管中；
4、先將細(xì)胞凍存管放置于-20℃1.5h，然后將其移入-80℃
三、應(yīng)用
MIA PaCa-2人胰腺導(dǎo)管癌貼壁細(xì)胞系可以用于Linc00152對(duì)胰腺癌細(xì)胞MIA PaCa-2增殖侵襲及遷移的影響：
探討長(zhǎng)鏈非編碼RNA Linc00152對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株MIA PaCa-2增殖、侵襲和遷移能力的影響。
方法：于醫(yī)院膽胰科采集到20對(duì)胰腺癌組織和其對(duì)應(yīng)的癌旁正常的胰腺組織;人正常胰腺細(xì)胞HPDE及各組胰腺癌細(xì)胞系MIA PaCa-2細(xì)胞、BxPC-3細(xì)胞、Capan2細(xì)胞購(gòu)于美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)驗(yàn)證組織及各組細(xì)胞中Linc00152的表達(dá)水平。
人胰腺癌細(xì)胞株MIA PaCa-2細(xì)胞隨機(jī)分為陰性對(duì)照組(si-NC組)和Linc00152下調(diào)組(si-Linc00152組)。設(shè)計(jì)Linc00152的siRNA(small interfering RNA)干擾模型,si-NC組和si-Linc00152組分別轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照序列(Negative control)、siRNA抑制序列,采用RT-qPCR驗(yàn)證兩組MIA PaCa-2細(xì)胞中Linc00152的轉(zhuǎn)染效率并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
采用CCK-8法和集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩組MIA PaCa-2細(xì)胞的增殖能力;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩組MIA PaCa-2細(xì)胞的細(xì)胞周期;Western-blot檢測(cè)兩組胰腺癌細(xì)胞MIA PaCa-2的細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclin D1、CDK4的表達(dá):
采用Transwell實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)兩組MIA PaCa-2細(xì)胞的侵襲、遷移能力;Western-blot檢測(cè)兩組MIA PaCa-2的細(xì)胞相關(guān)蛋白vimentin及N-cadherin的表達(dá)水平。結(jié)果:與癌旁正常的胰腺組織相比,Linc00152在胰腺癌組織中表達(dá)明顯增加(P<0.001),Linc00152在胰腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)均高于人正常胰腺細(xì)胞HPDE,且在MIA PaCa-2中表達(dá)最高(P<0.01)。
成功設(shè)計(jì)siRNA干擾模型,將陰性對(duì)照序列、siRNA抑制序列轉(zhuǎn)染48 h后,RT-qPCR結(jié)果顯示,與對(duì)照組si-NC組對(duì)比,si-Linc00152組中的Linc00152表達(dá)明顯降低(P<0.01)。分別于6 h、24 h、48 h、72 h、96 h加CCK-8溶液測(cè)兩組MIA PaCa-2的細(xì)胞活力,結(jié)果與si-NC組相比,si-Linc00152組中的細(xì)胞在48 h、72 h、96 h增殖顯著下降(P<0.01)。
集落形成實(shí)驗(yàn)8天后,si-NC組的集落形成數(shù)目是(412±12),而si-Linc00152組的集落形成是(226±8),結(jié)果顯示沉默Linc00152后細(xì)胞克隆數(shù)目明顯減少(P<0.01)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示沉默Linc00152后,與si-NC組相比,si-Linc00152組MIA PaCa-2在細(xì)胞周期中的G0/G1期百分比上升,提示發(fā)生了細(xì)胞周期阻滯(P<0.01)。
Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示,沉默Linc00152后細(xì)胞侵襲的數(shù)目明顯減少(P<0.01)。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中顯示,沉默Linc00152后細(xì)胞遷移的數(shù)目明顯減少(P<0.01)。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示,與對(duì)照組si-NC組對(duì)比,si-Linc00152組中細(xì)胞遷移,侵襲能力也顯著降低(P<0.01)。
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