一、背景
5637人膀胱癌細(xì)胞來(lái)自一名68歲男性白人的膀胱癌組織，現(xiàn)常用于泌尿系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)理研究。5637貼壁生長(zhǎng)，顯微鏡下呈上皮細(xì)胞樣，能生成SCF、IL-1、IL-3、IL-6、G-CSF、GM-CSF等。該細(xì)胞經(jīng)本庫(kù)STR鑒定結(jié)果無(wú)誤，且支原體檢測(cè)陰性。
5637人膀胱癌細(xì)胞推薦使用RPMI1640培養(yǎng)基，含10%胎牛血清，在37度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5637建議每周2-3次更換新鮮培養(yǎng)基，按1:3至1:4進(jìn)行傳代，37度胰酶消化3-4分鐘，傳代周期通常為2-3天。特別注意的是，該細(xì)胞相對(duì)較難消化，需要延長(zhǎng)消化時(shí)間，消化到細(xì)胞收縮變圓，輕拍培養(yǎng)瓶側(cè)邊，細(xì)胞可以滑落方可終止消化。
二、5637人膀胱癌細(xì)胞培養(yǎng)操作
1)復(fù)蘇5637人膀胱癌細(xì)胞：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說(shuō)明書為主。
將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2)5637人膀胱癌細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
b、加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細(xì)胞懸液按1：2比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3)5637人膀胱癌細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
下面T25瓶為例；
a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無(wú)血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應(yīng)用
5637人膀胱癌細(xì)胞可以用于SPTBN2基因在膀胱癌中的表達(dá)及對(duì)膀胱癌5637細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響：
研究非紅細(xì)胞血影蛋白β2(Spectrin Beta,Non-Erythrocytic 2,SPTBN2)在膀胱癌組織中的表達(dá),與臨床病理因素的相關(guān)性,以及對(duì)膀胱癌5637細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。
方法：
(1)通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)和GSE13507數(shù)據(jù)集,分析SPTBN2在膀胱癌中的表達(dá)情況,以及與患者預(yù)后和臨床病理因素的相關(guān)性。
(2)通過(guò)單基因GSEA分析和蛋白互作分析,研究SPTBN2可能涉及的信號(hào)通路和生物學(xué)功能。
(3)采用RNA干擾技術(shù)(RNA interfering,RNAi)沉默膀胱癌5637細(xì)胞中SPTBN2的表達(dá),實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組(blank control group,Blank組)、陰性對(duì)照組(negative control group,NC組)、siRNA#1實(shí)驗(yàn)組和siRNA#2實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染靶向SPTBN2 siRNA,NC組轉(zhuǎn)染通用陰性siRNA,空白對(duì)照組加入等量轉(zhuǎn)染試劑。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞中SPTBN2基因的表達(dá)水平,Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)SPTBN2蛋白的表達(dá)量。CCK-8法檢測(cè)膀胱癌5637細(xì)胞增殖情況。劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移、侵襲能力。
結(jié)果：
(1)本研究基于對(duì)TCGA膀胱癌數(shù)據(jù)集和GSE13507數(shù)據(jù)集的分析發(fā)現(xiàn)SPTBN2在膀胱癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁正常組織,高表達(dá)SPTBN2的患者預(yù)后較低表達(dá)SPTBN2患者差,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。SPTBN2在膀胱癌中的表達(dá)量與T分期(OR=2.152,95%CI=1.390-3.364,P<0.001)、N分期(OR=1.935,95%CI=1.257-2.999,P=0.003)和組織學(xué)類型(OR=10.313,95%CI=2.941-65.289,P=0.002)存在相關(guān)性。
(2)單基因GSEA富集分析顯示,SPTBN2相關(guān)差異基因主要富集在KRAS信號(hào)通路。KEGG富集分析顯示,SPTBN2相關(guān)互作蛋白主要富集于細(xì)胞凋亡、腫瘤蛋白多糖、線粒體自噬、縫隙連接、膀胱癌信號(hào)通路。GO富集分析顯示,SPTBN2相關(guān)互作蛋白在分子功能分類中主要富集于細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)形成、血影蛋白結(jié)合、離子通道結(jié)合。在細(xì)胞組分分類中主要富集于軸突始段、軸突主干、軸突部分。在生物過(guò)程分類中,富集于軸突導(dǎo)向、神經(jīng)元投射引導(dǎo)、膜電位調(diào)節(jié)。SPTBN2與MAPK信號(hào)通路相關(guān)基因KRAS(r=0.338,P<0.001)、RAF1(r=0.362,P<0.001)、MAP2K1(r=0.338,P<0.001)、MAPK1(r=0.382,P<0.001)、EGFR(r=0.360,P<0.001)具有相關(guān)性,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
(3)轉(zhuǎn)染SPTBN2 siRNA后,實(shí)驗(yàn)組的SPTBN2轉(zhuǎn)錄水平和SPTBN2蛋白表達(dá)量均低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組的增殖、遷移和侵襲能力較陰性對(duì)照組降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
結(jié)論：
(1)SPTBN2在膀胱癌中的表達(dá)量增加,與膀胱癌發(fā)展相關(guān),高表達(dá)SPTBN2的膀胱癌患者預(yù)后較差。
(2)沉默SPTBN2能夠抑制膀胱癌5637細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。
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