一、背景
小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)完全培養(yǎng)基(無(wú)說(shuō)明書(shū))用于小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)的原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)。
實(shí)驗(yàn)方法原理：將小鼠的成纖維細(xì)胞（MEF）從機(jī)體中取出，經(jīng)胰酶、螯合劑（常用EDTA）處理，分散成單細(xì)胞，置MEF生長(zhǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長(zhǎng)和繁殖。
二、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）原代培養(yǎng)步驟
1、用無(wú)菌眼科小剪刀或刮胡刀片將鼠胚軀干剪(切)成1mm3以下的碎塊，吸置于離心管內(nèi)。
2、加適量胰酶，將離心管置于培養(yǎng)箱中10-20分鐘
3、取出離心管，反復(fù)吹打，加足量培養(yǎng)液終止消化。
4、離心1000轉(zhuǎn)，5分鐘。
5、棄掉上清，加適量培養(yǎng)液，反復(fù)吹打20次。
6、分裝到T75中，一般每2個(gè)胚胎可以制成一個(gè)T75的原代細(xì)胞。
7、置37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
8、待細(xì)胞長(zhǎng)3-7天細(xì)胞互相重疊爬滿(mǎn)整個(gè)培養(yǎng)瓶底時(shí)即可1：3-1：6傳代。
9、吸棄培養(yǎng)液上清。
10、PBS（不含鈣鎂）沖洗兩次。
11、加0.25%胰酶-0.02EDT消化。
12、在顯微鏡下觀察，當(dāng)少量細(xì)胞漂浮，貼壁的細(xì)胞層出現(xiàn)裂隙時(shí)，用移液管吹打沖洗瓶底5-6次。
13、即刻加MEF培養(yǎng)液終止消化。
14、1000轉(zhuǎn)，5分鐘離心。吸棄上清。
15、加足培養(yǎng)液，吹打制成單細(xì)胞懸液，分裝到各T75中。完成傳代。
16、原代細(xì)胞中還有少量組織塊未被充分消化，在以后的每次傳代過(guò)程中要盡量制成單細(xì)胞懸液，組織塊會(huì)逐漸消失。
17、原代細(xì)胞中混有一些雜細(xì)胞，一般傳到第3代時(shí)，雜細(xì)胞逐漸減少。小鼠胚胎成纖維細(xì)胞為梭狀；但連成片時(shí)，細(xì)胞互相交聯(lián)，形態(tài)不典型。
三、應(yīng)用
用于Ptpn11E76K激活突變協(xié)同miR-100失活促進(jìn)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化研究：
用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞研究Ptpn11編碼的SHP-2蛋白激活突變調(diào)控腫瘤發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)制,并尋找改善患者預(yù)后的新型靶向腫瘤標(biāo)志物。SHP-2是一種普遍存在的非受體蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）,該P(yáng)TP包括兩個(gè)串聯(lián)Src同源結(jié)構(gòu)域（N-SH2和C-SH2）,它們起磷酸酪氨酸結(jié)合域的作用,并介導(dǎo)該P(yáng)TP與底物相互作用,在多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。SHP-2的功能失調(diào)能夠誘發(fā)Noonan綜合征、白血病、肺癌等。
前期研究發(fā)現(xiàn),SHP-2激活突變不僅增強(qiáng)細(xì)胞擴(kuò)散及血管生成,而且能夠調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)展中起重要作用的RAS-RAF等信號(hào)異?；罨?還發(fā)現(xiàn)其突變?cè)黾恿诵∈蠼Y(jié)直腸癌的發(fā)生。micro RNA（miRNA）是一類(lèi)內(nèi)源性非編碼小RNA（約22個(gè)核苷酸）,它與其靶基因3’-UTR區(qū)結(jié)合,降解靶mRNA或抑制其翻譯,參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,從而在許多人類(lèi)癌癥中異常表達(dá)并發(fā)揮作用。我們前期在砷誘導(dǎo)的SHP-2 D61G功能性突變的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中做基因芯片檢測(cè)多種miRNA表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)miR-100的表達(dá)顯著下降。研究發(fā)現(xiàn)miR-100參與調(diào)控多種細(xì)胞過(guò)程,在許多惡性腫瘤中異常表達(dá)并發(fā)揮作用。
方法：
1、取13.5d不同基因型的孕鼠制備原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEFs）,通過(guò)相應(yīng)胚胎組織的基因型鑒定后得到所需的MEFs并且純化。
2、用表達(dá)Cre重組酶的腺病毒（Ad-Cre-GFP）同時(shí)感染制備的四組MEF細(xì)胞。在Cre重組酶作用下,能夠?qū)76K前面的neo基因盒子敲除,從而表達(dá)E76K;并且Cre重組酶還可以利用識(shí)別loxp位點(diǎn)切除miR-100,實(shí)現(xiàn)miR-100功能失活。因此得到Ptpn11E76K突變和miR-100失活的MEF細(xì)胞株,進(jìn)一步通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中Cre,SHP-2,miR-100的表達(dá)情況來(lái)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。
3、衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色和相關(guān)細(xì)胞行為學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Ptpn11E76K激活突變和miR-100失活對(duì)MEF細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響:a.增殖實(shí)驗(yàn):MTT,Ki67的免疫熒光和流氏細(xì)胞術(shù),細(xì)胞周期分析b.細(xì)胞集落生長(zhǎng)能力:平板克隆c.細(xì)胞非錨定生長(zhǎng)情況:軟瓊脂集落形成d.遷移和侵襲能力:Transwell實(shí)驗(yàn),劃痕實(shí)驗(yàn)；
4、體內(nèi)實(shí)驗(yàn),建立裸鼠移植瘤模型檢測(cè)四組MEF細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)增殖情況并將移植瘤接種在C57/BL6小鼠皮下進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
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