一、背景
MCF-7B人乳腺癌細胞系是從一名69歲白人女性乳腺癌患者的胸腔積液中分離建立，常用于乳腺癌發(fā)病機理的研究。MCF-7B人乳腺癌細胞系來源于MCF-7細胞的一個亞克隆，表達高水平的褪黑素MT1受體的mRNA，對褪黑素有一定的敏感性。
人乳腺癌細胞系是用于研究乳腺癌的重要工具之一。通過研究這些細胞系，科學家們可以更好地了解乳腺癌的生物學特性、治療靶點以及藥物敏感性等方面的信息。MCF-7細胞系是其中一種廣泛使用的細胞系，而MCF-7B則是從MCF-7細胞系中獲得的一個亞克隆。MCF-7B人MCF-7B人乳腺癌細胞系屬于貼壁細胞，顯微鏡下呈現(xiàn)上皮細胞形態(tài)，且保留了多個分化乳腺上皮的特性，
包括：1）能通過胞質(zhì)雌激素受體加工雌二醇并能形成隆突結(jié)構(gòu)（domes）；
2）能表達WNT7B癌基因；
3）腫瘤壞死因子α（TNF alpha）可以抑制MCF-7B人乳腺癌細胞系細胞生長；
4）細胞經(jīng)抗雌激素處理能調(diào)節(jié)胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白（IGFBP）的分泌。
MCF-7B人乳腺癌細胞系細胞常用DMEM培養(yǎng)基，含10%胎牛血清，在37度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。MCF-7B人乳腺癌細胞系復蘇后貼壁相對較慢，每周2-3次更換新鮮培養(yǎng)基，按1:2至1:3比例傳代，胰酶消化室溫1-2分鐘，細胞培養(yǎng)時可添加0.01mg/mL胰島素，需要注意的是MCF-7生長較快，如不及時傳代可出現(xiàn)整瓶細胞漂浮。
二、MCF-7B人乳腺癌細胞系細胞培養(yǎng)特點
1、MCF-7細胞一般情況下是生長緩慢的細胞系，前期呈島狀生長，隨著細胞生長，細胞會逐步變成扁平單層細胞。通常需要6~12天才能達到80%生長密度，如果生長速度比正常情況還要緩慢，可能需要換另外批次的血清，把血清濃度提高到20%也有助于改善細胞生長情況。
2、細胞在復蘇和傳代后，會在培養(yǎng)基中觀察到成團的細胞漂浮物，對于這個細胞來說這是正常的情況，在復蘇和傳代后前三天可以靜置細胞不做處理，三天后貼壁情況會有所改善，但懸浮的細胞團仍會出現(xiàn)，這些懸浮的細胞是活細胞在換液和傳代時需要離心回收，這些懸浮細胞團可以通過使用移液器（5mL或者更?。﹣泶瞪?，重新打入到貼壁細胞培養(yǎng)瓶中。丟棄這些懸浮細胞會使細胞密度變低，細胞生長緩慢。
3、使用BC-CE-005胰酶-EDTA消化液（0.25%胰酶，含酚紅）消化細胞。
4、細胞消化較快，室溫消化即可；消化時不要通過敲擊或搖晃培養(yǎng)瓶來攪動細胞，以免形成細胞團。
三、應用
MCF-7B人乳腺癌細胞系可以用于miR let-7b抑制乳腺癌MCF-7細胞遷移及其機制的研究：
探討miR let-7b是否抑制乳腺癌細胞遷移及其可能與IL-6相關(guān)的作用機制，在評估乳腺癌患者的轉(zhuǎn)移及臨床早期預防和治療方面乳腺癌細胞的轉(zhuǎn)移提供理論依據(jù)。
方法：
1、體外培養(yǎng)人乳腺癌MCF-7細胞，將實驗組分為四組：空白對照組、miR let-7b轉(zhuǎn)染組、miR-control轉(zhuǎn)染組、anti-miR let-7b轉(zhuǎn)染組并分別轉(zhuǎn)染對應的人工合成miRNA，應用劃痕實驗方法，在顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后24h不同實驗組劃痕距離的改變而判斷細胞遷移能力的變化。
2、miR let-7b轉(zhuǎn)染組、miR-control轉(zhuǎn)染組、anti-miR let-7b轉(zhuǎn)染組分別轉(zhuǎn)染對應的人工合成miRNA培養(yǎng)48h后，粉碎細胞、提取RNA并反轉(zhuǎn)錄cDNA及提取蛋白，運用PCR和蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測細胞內(nèi)IL-6的表達水平。
3、通過capitalbio數(shù)據(jù)庫和生物信息學軟件TargetScan、DIANA-micoT3.0這兩個軟件兩兩比對，用載體構(gòu)建、雙熒光酶素報告基因方法驗證miR let-7b與IL-6結(jié)合。
4、統(tǒng)計學分析：所有數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標準差(x±S)表示。采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件統(tǒng)計處理，用方差分析方法進行各實驗組結(jié)果數(shù)據(jù)對比，采用LSD-t檢驗方法進行兩兩比較，認為當P<0.05時數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學意義。
結(jié)果：
1、劃痕實驗：將轉(zhuǎn)染miR-control、miR let-7b、anti-miR let-7b以及未轉(zhuǎn)染的MCF-7細胞分別接種于6孔板中，分為空白對照組、miR-control轉(zhuǎn)染組、miR let-7b轉(zhuǎn)染組、anti-miR let-7b轉(zhuǎn)染組，待細胞貼壁長滿進行劃痕實驗，在細胞生長0h、24h后分別進行拍照，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR let-7b的細胞的劃痕距離與空白對照組細胞的劃痕距離相比明顯增大，而轉(zhuǎn)染anti-miR let-7b的細胞其劃痕距離遠小于空白對照組劃痕距離。miR let-7b組與anti-miR let-7b組劃痕距離差距更為明顯，本實驗方法表明miR let-7b能夠明顯抑制乳腺癌MCF-7細胞的遷移能力，而anti-miR let-7b能夠明顯促進乳腺癌MCF-7細胞的遷移。
2、PCR實驗：將轉(zhuǎn)染miR-control、miR let-7b、anti-miR let-7b的乳腺癌MCF-7細胞培養(yǎng)48h后粉碎并提取總RNA、反轉(zhuǎn)cDNA，以其為模板進行PCR，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測并照相，并分析灰度值。miR-control、miR let-7b組和anti-miR let-7b組的PCR灰度值（IL-6/GADPH）為0.89±0.24，0.23±0.18，1.03±0.21，經(jīng)比對各組PCR條帶灰度值總體比較時差異有統(tǒng)計學意義（F=5.77，P<0.01）。經(jīng)miR let-7b轉(zhuǎn)染后的人乳腺癌MCF-7細胞，IL-6的表達強度與其余對照組相比明顯降低（t=5.32），而經(jīng)anti-miR let-7b轉(zhuǎn)染的細胞株內(nèi)IL-6表達水平顯著增高（t=4.00），其差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。miR let-7b組與anti-miRlet-7b組灰度值差異更為顯著。實驗結(jié)果說明miR let-7b明顯抑制IL-6的表達水平，而anti-miR let-7b能夠提高IL-6的表達水平。
3、蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)：將轉(zhuǎn)染miR let-7b、miR-control、anti-miR let-7b的乳腺癌MCF-7細胞培養(yǎng)48h后粉碎并提取總蛋白，實驗后行灰度值分析，蛋白質(zhì)條帶印跡灰度值（IL-6/β-肌動蛋白）分別為miR-control組0.76±0.28，miR let-7b組0.59±0.16，anti-miR let-7b組為1.22±0.23，各實驗組對比時發(fā)現(xiàn)各實驗分組總體比較時有差異（F=6.01，P<0.01）。實驗組miR let-7b與空白對照組相比，經(jīng)miR let-7b轉(zhuǎn)染的MCF-7細胞株中IL-6的表達水平相對降低（t=5.543，P=0.037）。而在另一實驗組，anti-miR let-7b轉(zhuǎn)染組內(nèi)IL-6的表達水平相對增高（t=5.713，p=0.008），其差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。miR let-7b組與anti-miR let-7b組灰度值差異更為顯著。實驗結(jié)果說明miR let-7b明顯抑制IL-6的表達水平，而anti-miR let-7b提高IL-6的表達水平。
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