一、背景
NK-92MI人惡性非霍奇金淋巴瘤患者NK細胞系是從一位患有急進性非霍奇金淋巴瘤的50歲白人男性外周血單核細胞衍生來的一株IL-2依賴型NK細胞株。NK-92MI細胞是轉(zhuǎn)染得到的源自NK-92細胞的IL-2非依賴的NK細胞株，親本細胞NK-92通過微粒體基因轉(zhuǎn)化法用逆轉(zhuǎn)錄病毒MFG-hIL-2載體攜帶的人IL-2cDNA進行轉(zhuǎn)化，可能由于載體整合到基因組DNA中，轉(zhuǎn)化是穩(wěn)定的。NK-92MI細胞細胞對很多惡性細胞有細胞毒性；鉻釋放試驗顯示它能殺死K562細胞和Daudi細胞。
NK-92細胞有以下特征：CD2、CD7、CD11a、CD28、CD45、CD54表面標記陽性；CD1、CD3、CD4、CD5、CD8、CD10、CD14、CD16、CD19、CD20、CD23、CD34和HLA-DR表面標記陰性。NK-92MI細胞和NK-92CI細胞這兩個變種都包含、表達并合成hIL-2cDNA。NK-92MI細胞合成的IL-2水平比NK-92CI高，而親本細胞不合成表達。1998年9月提交到ATCC的培養(yǎng)物污染了支原體，其后代通過BM細胞周期蛋白處理21天消除支原體，處理后6周，用Hoechst染色、PCR和標準培養(yǎng)測試進行支原體檢測，結(jié)果都呈陰性。
該細胞系的研究對于了解惡性非霍奇金淋巴瘤的發(fā)病機制、診斷和治療具有重要意義。研究人員可以通過觀察該細胞系的生長特性、增殖能力、殺傷活性等指標，探究其在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中的作用。此外，該細胞系還可以用于制備疫苗、抗體等生物制品，為臨床治療提供新的思路和方法。
二、NK-92MI人惡性非霍奇金淋巴瘤患者NK細胞系復(fù)蘇、傳代、凍存操作
（一）NK-92MI人惡性非霍奇金淋巴瘤患者NK細胞系細胞復(fù)蘇
①新制100mm平皿1個，含12mL上述培養(yǎng)液；
②凍存管從液氮或-80℃中取出，37℃水浴1~2min,待完全溶解后盡快移入安全柜復(fù)蘇；
③用無菌吸管吸取溶解液打入新制平皿中，順時針搖勻；
④放入（37℃，5%CO2）培養(yǎng)箱中，過夜換液，2-4天長滿。
注意：建議復(fù)蘇凍存細胞時始終使用防護手套、衣服和戴上防護面罩，避免凍存管處于溫差較大情況下發(fā)生爆炸造成人員傷害。
（二）NK-92MI人惡性非霍奇金淋巴瘤患者NK細胞系細胞傳代
將舊培養(yǎng)液吸除，PBS清洗兩遍后，加入2mL（/100mm皿/T25瓶）胰酶（0.25%Trypsin+0.02%EDTA），在顯微鏡下觀察，期間禁止搖晃培養(yǎng)皿，細胞剛有脫落時，吸除大部分胰酶，留約0.5mL，移至培養(yǎng)箱消化，約1min取出。傳代用6mL培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打均勻細胞，后可1:2傳代。
（三）NK-92MI人惡性非霍奇金淋巴瘤患者NK細胞系細胞凍存
凍存則用3mL凍存液（90%FBS+10%DMSO）終止消化，吹打均勻，分為3支凍存管，用程序降溫盒于-80℃凍存。
三、應(yīng)用
NK-92MI人惡性非霍奇金淋巴瘤患者NK細胞系可以用于神經(jīng)肽P物質(zhì)對NK-92MI細胞遷移及趨化因子受體表達的影響：
通過檢測SP對NK92-MI細胞遷移能力和細胞表面趨化因子受體表達的影響,探討SP對NK細胞的遷移活性的直接或間接調(diào)控作用;并通過測定SP對NK92-MI細胞上CCR7、CXCR3和CXCR4表達水平的影響,以及SP受體NK-1R在SP調(diào)控NK92-MI細胞遷移活性中的作用,進一步討論SP調(diào)控NK細胞遷移活性的機制。
研究方法：
(1)Transwell法檢測不同濃度的SP(10-12 mol/L、10-10 mol/L、10-8 mol/L、10-6 mol/L)對NK92-MI細胞遷移能力的影響以及不同濃度SP對趨化因子CCL21(CCR7配體)和CXCL12(CXCR4配體)對NK92-MI細胞趨化作用的影響。
(2)Real-time PCR檢測不同濃度的SP(10-12 mol/L10-6 mol/L)對NK92-MI細胞趨化因子受體CCR7、CXCR3和CXCR4 m RNA表達水平的影響。
(3)流式細胞術(shù)檢測不同濃度的SP(10-12 mol/L10-6 mol/L)對NK92-MI細胞趨化因子受體CCR7、CXCR3和CXCR4膜表達的調(diào)控。(4)NK-1R拮抗劑作用NK92-MI細胞后,再用Transwell法測定不同濃度SP及趨化因子CCL21和CXCL12對NK92-MI細胞的趨化作用;Real-time PCR測定趨化因子受體CCR7、CXCR3和CXCR4 m RNA表達水平的變化。
結(jié)果：
(1)SP對NK92-MI細胞的直接趨化作用,在10-12 mol/L10-10 mol/L濃度范圍內(nèi),隨SP濃度增高,NK92-MI細胞的遷移力也逐漸增強,10-10 mol/L濃度SP的促遷移作用最強;其后,SP濃度繼續(xù)增高,其促遷移作用反而逐漸減弱。不同濃度SP同樣可以增強趨化因子CXCL12和CCL21對NK92-MI細胞的趨化作用,在低濃度范圍(10-12 mol/L10-10 mol/L)SP作用下,NK92-MI細胞遷移力逐漸增加,而隨著SP濃度繼續(xù)增高(10-8 mol/L10-6 mol/L),NK92-MI細胞遷移力又有所減弱。
(2)SP可明顯增加趨化因子受體CCR7、CXCR3和CXCR4的m RNA表達。10-12mol/L10-6 mol/L濃度范圍的SP作用NK92-MI細胞6h,CCR7、CXCR3和CXCR4的m RNA表達均明顯增高;僅在10-12 mol/L濃度組,CXCR4的m RNA表達增高不明顯,與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)意義。SP作用NK92-MI細胞12h,各濃度(10-12mol/L10-6 mol/L)SP仍能顯著促進CXCR3和CXCR4的m RNA表達,而CCR7的m RNA表達水平無明顯增高。
(3)10-12 mol/L10-6 mol/L濃度范圍的SP對趨化因子受體CCR7、CXCR3和CXCR4的膜表達作用各不相同,其中CCR7的表達具有隨著SP濃度的增高而增加的趨勢,在10-8 mol/L和10-6 mol/L濃度組CCR7的表達有顯著增加(P<0.05);經(jīng)各濃度SP作用后,CXCR3的表達水平與對照組相比有所增加,但無統(tǒng)計學(xué)差異;而CXCR4表達則隨SP濃度的增高,具有先增高后回降的趨勢,10-10 mol/L和10-8 mol/L濃度的SP對CXCR4表達有明顯的促進作用(P<0.01、P<0.05)。SP對三種趨化因子受體表達的作用趨勢與SP促進NK92-MI細胞遷移能力的作用趨勢不完全一致,提示存在有各趨化因子受體的競爭表達,或可能還有其他趨化因子受體在協(xié)同發(fā)揮作用。
(4)經(jīng)NK-1R拮抗劑處理后,SP、CCL21和CXCL12均不能明顯增加NK92-MI細胞的遷移活性,且各濃度SP對CCR7、CXCR3和CXCR4 m RNA的表達無明顯促進作用,說明NK-1R拮抗劑發(fā)揮了阻斷作用,提示NK-1R是SP調(diào)控NK細胞遷移活性發(fā)揮作用的途徑。
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