一、背景
人神經母細胞瘤細胞是一種人神經母細胞瘤細胞系。這種細胞通常用于研究和了解神經母細胞瘤的生物學特征，以及探索相關的治療策略。
神經母細胞瘤是兒童最常見的顱外腫瘤，通常起源于交感神經系統(tǒng)的任意神經脊部位。SH-SY5Y細胞是在神經母細胞瘤的背景下分離出來的，因此，它們可以作為這種疾病模型的一部分，用于研究和理解疾病的病因、進程和響應治療方案。
二、人神經母細胞瘤細胞培養(yǎng)步驟
1、人神經母細胞瘤細胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：
1）準備基礎培養(yǎng)基(GIBCO，，添加NaHCO3 1.5g/L，丙酮酸鈉0.11g/L)；優(yōu)質胎牛血清，10%。
2）人神經母細胞瘤細胞培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）凍存液：90%完全培養(yǎng)基，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲存。
2、人神經母細胞瘤細胞處理：
1）復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或將細胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。
2）人神經母細胞瘤細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
對于貼壁細胞，傳代可參考以下方法：
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3.按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）人神經母細胞瘤細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。貼壁細胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后加入少量胰酶，細胞變圓脫落后，加入約1ml含血清的培養(yǎng)基后加入凍存管中，再添加10%DMSO后進行凍存。
三、應用
人神經母細胞瘤細胞可以用于核蛋白PCNP對人神經母細胞瘤細胞增殖和凋亡的影響：
探討PCNP基因過表達及沉默對人NB細胞增殖、遷移、侵襲和成瘤的影響,并尋找可能導致這些變化的機制。
方法：將PCNP過表達及干擾質粒轉染人NB細胞SH-SY5Y和SK-N-SH,并分別采用G418和嘌呤霉素篩選得到穩(wěn)定轉染細胞株,將得到的穩(wěn)定株采用MTS、EDU法檢測細胞增殖;采用TUNEL染色法檢測細胞凋亡水平變化;采用劃痕、transwell、invasion、soft agar實驗檢測細胞遷移和侵襲能力;并通過蛋白免疫印跡法Western blot檢測MAPK及PI3K/AKT/mTOR通路相關分子表達的變化;將PCNP過表達及沉默的人NB細胞注射入裸鼠腋下檢測PCNP對人NB細胞成瘤能力的影響。
結果：(1)成功構建PCNP過表達及沉默穩(wěn)定株;
(2)MTS、EDU檢測SH-SY5Y細胞和SK-N-SH細胞增殖情況,結果顯示PCNP過表達抑制細胞增殖,沉默促進細胞增殖;
(3)Tunel染色法檢測細胞凋亡,結果顯示PCNP過表達促進NB細胞凋亡,沉默抑制凋亡;
(4)劃痕和transwell法檢測PCNP對NB細胞遷移能力的影響,結果表明PCNP過表達后細胞遷移能力減弱,沉默后增強;
(5)invasion和soft agar實驗檢測細胞侵襲能力,結果表明PCNP過表達減弱NB細胞侵襲能力,而PCNP沉默侵襲增強;
(6)Western blot結果顯示PCNP過表達后Cleaved Caspase3、Cleaved Caspase8、Cleaved Caspase9表達增多,而PCNP沉默后表達減少;PCNP過表達導致SH-SY5Y細胞bax表達增多,bcl-2表達減少;相反PCNP沉默導致細胞bax表達減少,bcl-2表達增加,與凋亡實驗結果一致;因此PCNP可能通過調控細胞凋亡而影響生長;
(7)Western blot檢測MAPK及PI3K/AKT/mTOR信號通路相關分子表達的變化,結果顯示PCNP過表達后p-JNK、p-P38和p-Erk表達增多,而磷酸化的PI3K、AKT、mTOR與對照相比表達減少;而PCNP沉默后磷酸化的JNK、P38和Erk表達減少,磷酸化的PI3K、AKT、mTOR表達增多,因此PCNP可能通過MAPK信號轉導通路調控NB細胞凋亡,通過PI3K/AKT/mTOR通路調控NB增殖;
(8)注射PCNP過表達細胞的裸鼠腋下腫瘤較對照組減小,注射PCNP沉默細胞的裸鼠腋下形成的腫瘤較對照組增大。
結論：1、PCNP抑制人NB細胞SH-SY5Y和SK-N-SH增殖;
2、PCNP促進人NB細胞凋亡;
3、PCNP抑制人NB細胞遷移和侵襲;
4、PCNP可能通過MAPK信號轉導通路和PI3K/AKT/mTOR通路調控細胞凋亡及增殖;
5、PCNP抑制人NB細胞移植瘤形成。
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